Role of Brain-Derived Neurotrophic Factor and Mitochondrial Function in Huntington's Disease

Abstract

Huntington’s disease (HD) is a fatal and inherited autosomal dominant neurodegenerative disorder caused by a single mutation, an expansion of unstable CAG repeats in the coding region of the HD gene, leading to a polyglutamine expansion at the N-terminus of the huntingtin (Htt) protein. HD is primarily considered a hyperkinetic disorder characterized by motor dysfunction, behavioral and psychiatric disturbances, cognitive impairment and, at the cellular level, by a selective loss of striatal neurons. Deficient neurotrophic support and mitochondrial dysfunction have been reported as possible mechanisms underlying HD pathogenesis. In this thesis we aimed to determine the role of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and BDNF-mediated TrkB receptor signaling, and the involvement of mitochondrial dysfunction in neural differentiation and cell survival pathways in HD affected cells. In Chapter 2 we studied the influence of BDNF and TrkB receptor-overexpression in striatal cell lines derived from homozygous HD knock-in and wild-type mice. AKT activation was observed in BDNF and TrkB-overexpressing HD cells and in TrkB-overexpressed HD cells exposed to recombinant human BDNF. Increased phosphorylation of ERK was detected in HD BDNF/TrkB co-cultures and in both HD non-transduced and TrkB-overexpressing cells incubated with BDNF. The benefits of TrkB overexpression were further confirmed after the observation of reduced apoptotic cell death features (evaluated through analysis of caspase-3 activation and fragmented DNA) in mutant cells, suggesting that TrkB receptor-mediated AKT signaling may trigger survival mechanisms in HD striatal cells. Considering that adult neurogenesis appears to be inefficient in eliciting endogenous functional neuronal replacement in HD, in Chapter 3 we characterized the formation of new neurons derived from subventricular zone (SVZ) neurospheres. Thus, we described how undifferentiated cells derived from the SVZ of transgenic YAC128 mice, bearing full-length human mutant Htt, responded to neuronal differentiation induced by BDNF. In an undifferentiated state (as neurospheres), YAC128 and wild-type SVZ cells derived from animals with 6 or 10 months, at different stages of HD pathology, displayed similar proliferation and cell cycle phases. Nevertheless, at a mild HD stage (at 6 months of age) YAC128 cells exhibited higher migratory capacity, compared to WT cells, a difference not observed at a late HD symptomatic stage (at 10 months of age). Moreover, 6 month-old YAC128 cells exhibited a higher number of microtubule-associated protein 2 (MAP2)+ and synaptophysin+ cells than WT cells, suggesting that HD cells possess increased capacity to differentiate into mature neurons, capable of forming synapses. Importantly, differences observed between HD and wild-type cells at a mild symptomatic stage of HD were lost with the progression of the disease (at 10 months of age). 6 month-old YAC128 SVZ-derived cells also showed increased intracellular Ca2+ levels in response to KCl, which was promoted by BDNF, evidencing the presence of mature neurons; interestingly, these features were diminished in 10 month-old YAC128 cells. Late symptomatic YAC128 cells also displayed lower mitochondrial membrane potential and increased mitochondrial Ca2+ accumulation, compared to mild symptomatic YAC128 cells. These data evidence reduced migration and neuronal differentiation potential, along with decreased mitochondrial function in YAC128 mice SVZ-derived cells in advanced HD symptomatic phases. In the last chapter of this work (Chapter 4) we defined mitochondrial dysfunction at different symptomatological stages of HD in mitochondria isolated from human peripheral platelets. We determined mitochondrial complexes (I-IV) activities, nuclear- and mitochondrial-encoded subunit protein expression levels and mitochondrial energy levels in mitochondrial platelets from non-medicated pre-symptomatic and medicated symptomatic HD patients versus aged-matched controls. Data herein provide evidence for decreased activity of citrate synthase and mitochondrial complex I in mitochondrial platelets from pre-symptomatic individuals and increased complex IV activity in mitochondrial platelets from symptomatic HD patients. Significant and positive correlations were observed between complex I activity and 20 kDa mitochondrial-encoded subunit, as well as between complex II activity and 30 kDa nuclear-encoded subunit in HD symptomatic samples only. In addition, AMP levels were significantly increased in pre-symptomatic HD carriers. Taken together, these data suggest the hypothesis that dysfunction of mitochondrial complexes may occur very early during HD progression. Moreover, biochemical analysis of peripheral cells derived from HD carriers might be relevant in deciphering HD markers. Overall, the results presented in this thesis support the importance of deregulated neurotrophic signaling and dysfunctional mitochondria in HD pathogenesis. In particular, these data highlight the importance of BDNF in promoting the survival of striatal cells, the most affected cell population in HD brain, and reveal modified age-dependent responses of HD affected cells to this neurotrophin. Indeed, BDNF and TrkB receptor may be considered strong HD therapeutic candidates. The results herein presented suggest increased mitochondrial membrane potential during neuronal differentiation in vitro, at a mild stage of the disease in HD mice, possibly reflecting a compensatory response to the effects caused by mutant Htt. Moreover, data show that mitochondrial deficits are early events in HD pathogenesis, occurring in pre-symptomatic stages of the disease in peripheral human cells, which might be relevant when considering the use of mitochondrial-based therapeutic interventions.

A doença de Huntington (HD, do inglês Huntington’s disease) é uma doença fatal hereditária, autossómica dominante, resultante de uma única mutação, uma expansão de repetições do tripleto instável CAGCAG na região codificante do gene da huntingtina, conduzindo à expansão de poliglutaminas no terminal amínico da proteína huntingtina (Htt). A HD é caracterizada por hipercinésia, disfunção motora, distúrbios comportamentais e psiquiátricos, défice cognitivo e, a nível celular, pela perda seletiva de neurónios estriatais. Um défice do suporte neurotrófico e disfunção mitocondrial têm sido descritos como mecanismos associados à patogenia da HD. Neste trabalho determinámos o papel do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF, do inglês brain-derived neurotrophic factor) e da sinalização do recetor TrkB mediada por BDNF, e o envolvimento da disfunção mitocondrial na diferenciação neuronal e nas vias de sobrevivência celular em células afetadas pela HD. No Capítulo 2 analisámos a influência da sobrexpressão de BDNF e TrkB em células estriatais derivadas de murganhos homozigóticos knock-in para a HD e murganhos wild-type. Observámos a ativação da AKT em células HD que sobre-expressam BDNF e TrkB e em células HD que sobre-expressam TrkB expostas à forma recombinante humana de BDNF. Detetámos ainda um aumento da fosforilação da ERK em co-culturas de células HD que sobre-expressam BDNF ou TrkB e em células controlo (não infetadas) e células que sobre-expressam TrkB expostas a BDNF. Os benefícios da sobre-expressão do recetor TrkB foram confirmados após observação da redução da morte celular por apoptose (avaliada através da análise da ativação da caspase-3 e da fragmentação do DNA) em células mutantes, sugerindo que a sinalização da AKT mediada pelo recetor TrkB pode desencadear mecanismos de sobrevivência em células estriatais HD. Considerando que a neurogénese adulta parece ser ineficiente no processo de substituição endógena de neurónios funcionais na HD, no Capítulo 3 caracterizámos a formação de novos neurónios derivados de neurosferas da zona subventricular (SVZ, do inglês subventricular zone). Assim, observámos o processo de diferenciação neuronal em resposta a BDNF, a partir de células indiferenciadas derivadas da SVZ de murganhos transgénicos YAC128, que expressam a Htt mutante humana completa, em diferentes estadios da doença. Num estadio indiferenciado (como neurosferas), as células derivadas da SVZ obtidas de murganhos YAC128 e wild-type apresentaram um perfil de proliferação e ciclo celular semelhantes. No entanto, num estadio moderado da HD (aos 6 meses de idade) as células YAC128 exibiram uma capacidade migratória superior, comparativamente às células derivadas de murganhos wild-type; contudo esta diferença não foi observada num estadio mais avançado da doença, aos 10 meses de idade. Além disso, as células derivadas de murganhos YAC128 com 6 meses de idade apresentaram um maior número de células positivas para a proteína associada aos microtúbulos 2 (MAP2, do inglês microtubule-associated protein 2) e sinaptofisina, comparativamente às células wild-type, sugerindo que as células HD possuem uma maior capacidade de diferenciação em neurónios maduros, capazes de formar sinapses. De forma interessante, os resultados obtidos nas células YAC128 num estadio moderado da HD desapareceram numa fase mais avançada da progressão da doença, i.e., aos 10 meses de idade. As células derivadas da SVZ de murganhos YAC128 com 6 meses de idade também demonstraram um aumento dos níveis de Ca2+ intracelular em resposta à despolarização por KCl, que foi incrementado na presença de BDNF, evidenciando a presença de neurónios maduros; contudo, estas características apresentaram-se diminuídas nas células YAC128 aos 10 meses de idade. Num estadio mais avançado da doença, as células YAC128 apresentaram um menor potencial mitocondrial transmembranar e um aumento da acumulação de Ca2+ mitocondrial, comparativamente às células YAC128 num estadio moderado da doença. Estes dados demonstram uma redução da capacidade migratória e do potencial de diferenciação neuronal, e uma diminuição da função mitocondrial em células derivadas da SVZ de murganhos HD YAC128 em fases sintomáticas e avançadas da HD. No último capítulo deste trabalho (Capítulo 4) avaliámos a disfunção mitocondrial em diferentes fases sintomáticas da HD, em mitocôndrias isoladas a partir de plaquetas periféricas humanas. Neste estudo determinámos a atividade dos complexos mitocondriais (I-IV), os níveis proteicos de subunidades codificadas pelo núcleo e pela mitocôndria, e os níveis energéticos em mitocôndrias de plaquetas derivadas de doentes pré-sintomáticos (não medicados) e doentes HD (medicados), versus controlos com idade semelhante. Os resultados evidenciaram um decréscimo da atividade da enzima citrato sintetase e do complexo I mitocondrial em mitocôndrias de plaquetas de indivíduos pré-sintomáticos e um aumento da atividade do complexo IV em mitocôndrias de plaquetas derivadas de doentes HD. Observaram-se correlações positivas e significativas entre a atividade do complexo I e a subunidade de 20 kDa codificada pela mitocôndria, assim como entre a atividade do complexo II e a subunidade de 30 kDa codificada pelo núcleo, apenas nas amostras derivadas de doentes com HD. Para além disso, os níveis de AMP apresentaram-se significativamente aumentados em indivíduos pré-sintomáticos, portadores da mutação. Em conjunto, os resultados do Capítulo 4 levantam a hipótese de que a disfunção dos complexos mitocondriais possa ocorrer muito cedo durante a progressão da doença. Desta forma, a análise bioquímica de células periféricas derivadas de portadores da mutação poderá ser relevante na ‘descodificação’ de marcadores periféricos para a HD. Globalmente, os resultados apresentados nesta tese realçam o défice da sinalização neurotrófica e a disfunção mitocondrial como fatores importantes para a patogenicidade que ocorre na HD. Em particular, os dados demonstram a importância do BDNF na promoção da sobrevivência de neurónios estriatais, a população cerebral mais afetada na HD, e na aquisição de um fenótipo neuronal maduro; contudo, dependendo da idade e estadio da HD (definida no modelo transgénico YAC128), as células revelam respostas divergentes a BDNF relativamente ao processo de diferenciação neuronal. Nesta perspetiva, o BDNF e o recetor TrkB poderão ser considerados fortes candidatos para o tratamento da doença. Numa fase moderada da doença no modelo transgénico da HD, o processo de diferenciação neuronal in vitro evidenciou um aumento do potencial mitocondrial transmembranar, que poderá resultar de um efeito compensatório relativamente aos efeitos causados pela mHtt. Para além disso, demonstramos que os défices mitocondriais ocorrem precocemente na HD, em fases pré-sintomáticas da doença, tal como observado em células periféricas humanas, o que pode ser relevante se considerarmos o uso de intervenções terapêuticas baseadas na mitocôndria.