Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/23092
Title: Análise experimental da patogenicidade de variações de sequência novas no genoma mitocondrial
Authors: Bacalhau, Mafalda Rita Avó 
Orientador: Grazina, Manuela
Keywords: Genoma humano; Genoma; Mitocôndrias; Doenças mitocondriais; Mutação; Citopatias mitocondriais
Issue Date: 2012
Citation: BACALHAU, Mafalda Rita Avó - Análise experimental da patogenicidade de variações de sequência novas no genoma mitocondrial. Coimbra : 8s.n.], 2012. Dissertação de mestrado
Abstract: As citopatias mitocondriais são um grupo de doenças heterogéneas, causadas por defeitos no sistema mitocondrial de produção de ATP. Este organelo tem o seu próprio genoma (mtDNA) que, quando sofre lesões/mutações, origina subunidades da cadeia respiratória mitocondrial (CRM) anormais, comprometendo o bom funcionamento da fosforilação oxidativa (OXPHOS) e, consequentemente, a síntese de ATP. Assim, é admissível que mutações, em qualquer gene essencial à integridade e funcionamento da CRM, possam causar alterações a nível da estrutura e função mitocondriais. Mutações pontuais no mtDNA incluem as que causam decréscimo na síntese de proteínas mitocondriais e as que afetam alguma das 13 subunidades da CRM, codificadas por aquele genoma. Uma vez que o mtDNA é altamente polimórfico, o significado patogénico de uma nova alteração de sequência detetada, necessita de ser determinado, usando uma série de critérios antes de se poder estabelecer o diagnóstico genético. O objetivo do presente trabalho é avaliar experimentalmente a patogenicidade de 12 novas variações de sequência no mtDNA, detetadas previamente no Laboratório de Bioquímica Genética do Centro de Neurociências e Biologia Celular, da Universidade de Coimbra (Responsável: Professora Doutora Manuela Grazina), em indivíduos portugueses com suspeita de citopatia mitocondrial, no período compreendido entre 1997 e 2010. No sentido de avaliar o impacto das variações de sequência, foram realizados diversos estudos, nomeadamente a verificação da sua ausência em controlos, por sequenciação automática. Foi ainda efetuada a determinação do seu efeito na expressão dos níveis dos transcritos respetivos por PCR em tempo real, na quantidade de proteína, por Western-blot, e na atividade dos complexos da CRM por espectrofotometria, em fibroblastos de cultura. Uma análise prévia in silico demonstrou que 4 das 12 alterações alteram o aminoácido e têm probabilidade de alterar a função da proteína, 2 alteram a estrutura de dois tRNAs e as restantes alteram o codão para outro menos frequentemente usado, no genoma mitocondrial. Os resultados experimentais obtidos no presente trabalho para a alteração m.14771C>A, no gene MT-CYB, que codifica uma subunidade do complexo III da CRM, mostram que, quando comparados com os valores controlo, os níveis do transcrito respetivo estão significativamente diminuídos, por outro lado os níveis da proteína que se encontram ligeiramente diminuídos. No que diz respeito à atividade dos complexos da CRM, verificou-se um aumento significativo na atividade do complexo III, nas células estudadas. É de notar que o presente trabalho representa uma contribuição científica original, dado que permite analisar o impacto das alterações em estudo de uma forma mais detalhada e precisa. Assim, de acordo com os critérios de patogenicidade, podemos concluir que a alteração m.12013G>A é “definitivamente” patogénica, a m.144771C>A obteve uma pontuação que permite atribuir a classificação de “provavelmente” patogénica, e as restantes alterações mantêm a previsão de “potencialmente” patogénicas, até poderem ser efetuados mais estudos.
Mitochondrial disorders are a heterogeneous group of disorders that are caused by defects in the mitochondrial ATP production system. This organelle has its own genome (mtDNA), that when injured leads to the formation of abnormal mitochondrial respiratory (CRM) subunits, jeopardizing the proper functioning of oxidative phosphorylation (OXPHOS) and therefore ATP syntheses. Then, mutations in any gene essential for integrity and function of CRM could cause structural and functional mitochondrial alterations. The mtDNA point mutations include those that impair mitochondrial protein synthesis and those that affect any of the 13 CRM subunits encoded by mtDNA. Given the fact that mtDNA is highly polymorphic, the pathogenic significance of a detected novel sequence alteration needs to be determined using a series of criteria before a genetic diagnosis can be established. With this study, we aim to evaluate the pathogenicity of 12 novel mtDNA mutations, previously detected in Biochemical Genetics Laboratory of Center of Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra (Director: Professor Manuela Grazina), found in Portuguese patients suspected of mitochondrial cytophaties, in the period from 1997 to 2010. In order to assess the impact of these sequence variations, the study was conducted to verify their absence in controls, by automated sequencing. Furthermore, the determination of its effect in transcripts expression levels by Real-Time PCR, in protein levels by Western blot and in CRM complexes activity by spectrophotometry, using primary culture fibroblasts, was also performed. A previous in silico analysis showed that 4 of the 12 sequence variations change the amino acid and have probability to alter the protein function, 2 induce alterations of tRNAs structure and the remaining alter the codon to another less frequently used codon. The experimental results obtained for the sequence variation m.14771C>A, located in MT-CYB gene that encodes a complex III subunit of CRM, show that, when compared with control value, the transcript expression levels are significantly decreased and protein levels that are slightly diminished. Regarding CRM to complexes activity, it is significantly increased for complex III, in these cells. It is noteworthy that this study represents an original scientific contribution, allowing to analyze in more detail and precision the impact of these sequence variations. Therefore, according to published pathogenic criteria, we conclude that m.12013G>A mutation is considered “definitely” pathogenic, m.144771C>A mutation is “probably” pathogenic, while the remaining mutations are “potentially” pathogenic, until further studies can be performed.
Description: Dissertação de mestrado em Investigação Biomédica (Neurobiologia), apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/23092
Rights: openAccess
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