The role of calpains on TrkB and Gephyrin cleavage under excitotoxic conditions: Characterization and functional implications

Abstract

Stroke is a cerebrovascular incident mainly caused by the blockage (ischemia) of an artery responsible for the blood supply to the brain (e.g. middle cerebral artery), causing a significant neurological impairment. In the Western European countries, including Portugal, stroke is one of the main causes of death. The occlusion of blood vessels is followed by a cascade of events that take place over time: overactivation of glutamate receptors causing metabolic anomalies (excitotoxicity), perinfarct depolarization, inflammation and cell death. Excitotoxicity is one of the first steps of ischemic stroke and is also an important trigger and executioner in other neurological disorders. Excitotoxic mechanisms can cause acute cell death (necrosis) or initiate molecular events that lead to a delayed type of cell death, such as apoptosis. Excitotoxicity is still considered a prime target for stroke therapy although no clinical drug has reached the bedside of patients. It has also been shown to be a key player in spinal cord injury, traumatic brain injury and more recently in neurodegenetative diseases. Neurotrophins have proven to support survival and differentiation of neuronal populations both in the central and peripheral nervous system and in particular Brainderived neurotrophic factor (BDNF) has been shown to provide neuroprotection in different brain regions. BDNF rescues different types of neurons from various injuries, such as ischemia, trauma, and in several neurodegenerative disorders. In addition to the effects observed upon addition of exogenous BDNF the endogenous neurotrophin also provides neuroprotection to neuronal networks. BDNF plays an important role in neuronal survival in the CNS through activation of TrkB receptors. The trkB gene encodes full-length tyrosine kinase receptors (TrkB.FL) and truncated (T1 and T2) isoforms. In this work we investigated the changes in TrkB protein levels and signaling activity under excitotoxic conditions. We found that excitotoxic stimulation of cultured hippocampal or striatal neurons downregulates the TrkB.FL and upregulates a truncated form of the receptor. Downregulation of TrkB.FL was sensitive to calpain inhibitors whereas the increase in TrkB.T protein levels required de novo transcription and translation. The down-regulation of TrkB.FL receptors in hippocampal neurons subjected to excitotoxic conditions correlated with a decrease in BDNF-induced activation of the Ras/ERK pathway but inhibition of calpain, which prevents TrkB.FL degradation, did not affect its signaling activity. In contrast, incubation with anisomycin, to prevent the upregulation of TrkB.T, protected to a large extent the TrkB.FL signaling activity, suggesting that the truncated receptors act as a dominant negative. The upregulation of TrkB.T under excitotoxic conditions was correlated with an increased signaling activity as RhoA inhibitor. In the presence of BDNF the TrkB.T receptors may provide neuroprotection by inhibiting RhoA and the downstream neurotoxic cascade. Altogether the results obtained in this work further indicate that calpains play an important role in neuronal deregulation following excitotoxic injury, affecting the TrkB-mediated trophic support by BDNF. The research in cerebral ischemia and excitotoxic neuronal damage has been focused mainly on the excitatory mediators and much less is known regarding the changes in GABAergic activity, which accounts for most of the inhibitory effects in the CNS. The release of GABA in the ischemic brain and the consequent activation of GABAA receptors may be neuroprotective through reduction of membrane depolarization. Gephyrin is a scaffold protein responsible for the traffic and anchoring of Glycine and GABAA receptors, and changes in the expression and oligomerization of this protein may produce alterations in the activity of GABAergic synapses. In this work we investigated the changes in gephyrin protein levels during ischemia and in excitotoxic conditions, which may affect its oligomerization. We found that gephyrin is cleaved following excitotoxic stimulation of hippocampal or striatal neurons with glutamate, giving rise to a cleavage product with about 47 kDa. Gephyrin cleavage was also observed after transient middle cerebral artery occlusion (MCAO) in mice, a model of focal cerebral ischemia, and following intrahippocampal injection of kainate. The latter effect was not observed in transgenic mice overexpressing calpastatin, an endogenous inhibitor of calpain, indicating that calpains mediate gephyrin cleavage under excitotoxic conditions. Accordingly, the calpain chemical inhibitors MDL28170 and ALLN prevented gephyrin cleavage in hippocampal neurons subjected to excitotoxic stimulation with glutamate. Collybistin is another important partner of gephyrin and GABAARs at the synapse, and we showed that this protein is also cleaved under excitotoxic conditions by calpains. Altogether these results suggest that calpains may play an important rolein the deregulation of GABAergic synaptic transmission in brain ischemia.

Os acidentes vasculares cerebrais (AVC) são causados principalmente por um bloqueio das artérias responsáveis pela irrigação do cérebro, como por exemplo a artéria cerebral média, levando à interrupção da circulação sanguínea. Os AVC podem provocar danos neurológicos significativos e são uma das principais causas de morte na Europa Ocidental, incluindo em Portugal. Os AVC isquémicos desencadeiam uma cascata de eventos ao longo do tempo: activação excessiva de receptores do glutamato com consequentes alterações metabólicas (excitotoxicidade), despolarização da membrana plasmática, inflamação e morte celular. A excitotoxicidade é um dos primeiros passos dos AVC e contribui também para a morte neuronal em outras patologias do sistema nervoso. Os mecanismos de excitotoxicidade podem levar á morte neuronal de forma aguda (necrose) ou desencadear eventos moleculares que levam a uma morte celular retardada, como a apoptose. A excitotoxicidade é ainda considerada como um dos principais alvos para a terapia do AVC, embora nenhum fármaco tenha sido ainda encontrado com eficácia nestes pacientes. A excitotoxicidade também desempenha um papel importante na morte celular em resposta a lesões da espinhal medula, traumatismos cranianos e em doenças neurodegenerativas. As neurotrofinas desempenham um papel importante na sobrevivência e na diferenciação nuronal, tanto no sistema nervoso central como no sistema nervoso periférico. Em particular, os efeitos neuroprotectores do BDNF têm sido largamente investigados em condições de isquémia, trauma e em diversas doenças neurodegenerativas. O BDNF desempenha um papel importante na sobrevivência neuronal no Sistema Nervoso Central através da activação dos receptores TrkB. O gene trkB codifica os receptores com actividade de tirosina cinase (TrkB.FL) e as isoformas truncadas (T1 e T2) sem actividade catalítica. Neste trabalho, investigámos as alterações nos níveis de proteína de TrkB e na sua actividade de sinalização, em condições de excitotoxicidade. Verificou-se que a estimulação excitotóxica dos neurónios do hipocampo e do estriado em cultura provoca a diminuição dos níveis de TrkB.FL e aumenta os níveis das suas formas truncadas. A diminuição dos níveis de TrkB.FL foi mediado pela actividade de calpaínas, enquanto que o aumento dos níveis de TrkB.T foi eliminado na presença de inibidores da transcrição e da tradução.A diminuição dos níveis proteicos de TrkB.FL em neurónios do hipocampo sujeitos a condições excitotóxicas correlacionou-se com a diminuição da actividade da cascata de sinalização Ras/ERK induzida por BDNF. No entanto, a inibição de calpaínas de modo a impedir a degradação dos receptores TrkB.FL não permitiu manter a activação da via da Ras/ERK em resposta à estimulação com BDNF.Pelo contrário, a inibição da transcrição com anisomicina, de modo a impedir o aumento do número de receptores TrkB.T em neurónios sujeitos a condições de excitotoxicidade, assegurou a manutençãoda actividade de sinalização intracelular induzida por estimulação com BDNF. Estes resultados sugerem que os receptores TrkB.T formados em condições de excitotoxicidade actuam como dominantes negativos. O aumento dos níveis de TrkB.T em condições de excitotoxicidade resultou também num aumento da sua actividade de sinalização como inibidor da RhoA. Os resultados obtidos sugerem que o efeito de dominante negativo resultante do aumento dos níveis de TrkB.T relativamente ao número de receptores TrkB.FL pode contribuir para a neurodegeneração em condições excitotóxicas, através da diminuição dos efeitos tróficos do BDNF. Por outro lado, na presença de BDNF os receptores TrkB.T parecem ser neuroprotectores ao inibirem a actividade da RhoA e a cascata de morte celular que resulta da actividade desta proteína. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que as calpainas desempenham um importante papel na desregulação neuronal que sucede a uma lesão excitotóxica, afectando os efeitos tróficos do BDNF mediados pelos receptores TrkB.FL. A investigação em isquémia cerebral e o estudo dos danos neuronais resultante da excitotoxicidade têm sido focados principalmente nos efeitos excitotóxicos e muito menos é sabido acerca das alterações ocorridas na actividade GABAérgica, a qual é responsável pela maioria dos efeitos inibitórios no Sistema Nervoso Central. A libertação de GABA na zona do cérebro que sofre a lesão isquémica e a consequente activação dos receptores GABAA pode ter efeitos neuroprotectores através da redução da despolarização da membrana. A gefirina é uma proteína responsável pelo tráfego e estabilização dos receptores GABAérgicos e Glicinérgicos na sinapse. Consequentemente, alterações na expressão da gefirina e na sua oligomerização podem causar alterações na actividade das sinapses inibitórias. Neste trabalho foram investigadas as alterações ao nível da expressão da gefirina durante insultos excitotóxicos ou isquémicos, as quais podem ter um efeito significativo na organização desta proteína na sinapse. A estimulação excitotóxica com glutamato induziu a clivagem da gefirina, originando um produto de clivagem de 47 kDa, em culturas de neurónios do hipocampo e do estriado. A clivagem da gefirina foi também observada em situação de oclusão da artéria média cerebral (MCAO) em murganhos (um modelo de isquémia cerebral) assim como após a injecção de cainato no hipocampo de murganhos. No entanto, neste último modelo, a clivagem da gefirina foi atenuada em animais transgénicos que sobrexpressam a calpastatina, um inibidor endógeno da calpaína. De acordo com estas observações, a clivagem da gefirina não foi observada em neurónios do hipocampo em cultura submetidos a um estímulo excitotóxico com glutamato na presença dos inibidores das calpaínas ALLN ou MDL28170. No conjunto estes resultados mostram que as calpaínas são responsáveis pela clivagem da gefirina em condições de excitotoxicidade. A colibistina é outro importante interactor da gefirina e dos receptores GABAA nestas sinapses, e verificámos que esta proteína também é clivada pelas calpaínas em condições de excitotoxicidade. Em resumo, os resultados obtidos nesta tese sugerem que as calpaínas desempenham um papel importante na desregulação da transmissão GABAérgica e nas alterações dos efeitos tróficos do BDNF em condições de excitotoxicidade.