Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/10316/22672
Title: A systematic investigation of the potencial use of surfactants as microbicides: implications for surfactant use in the prophylaxis of sexually transmitted infections
Authors: Inácio, Ângela Rosalina Sanches 
Orientador: Vieira, Maria Otília Vitoriana
Vaz, Winchil L. C.
Duarte, Emília da Conceição Pedrosa
Issue Date: 14-Mar-2013
Citation: INÁCIO, Ângela Rosalina Sanches - A systematic investigation of the potencial use of surfactants as microbicides: implications for surfactant use in the prophylaxis of sexually transmitted infections. Coimbra : [s.n.], 2013. Tese de doutoramento
Abstract: As infecções sexualmente transmissíveis (ISTs) representam um grave problema de saúde pública em todo o mundo. Segundo a Organização Mundial de Saúde, por ano surgem 340 milhões de novos casos de ISTs causadas por bactérias e protozoários (Gonorréia, Sífilis, Clamídia e Tricomoníase), um número que não inclui os milhões de novos casos de ISTs com origem em fungos (Candidíase) e vírus (Herpes Simplex tipo 2, Hepatite B, VPHs e VIH). Os custos directos do tratamento e os danos colaterais perinatais graves provocados pelas ISTs representam pesados encargos financeiros e sociais, particularmente nos países em desenvolvimento. Assim sendo, a necessidade urgente de microbicidas para uso tópico, baratos, seguros, eficazes, fáceis de usar e de armazenar e cuja utilização na profilaxia de ISTs possa ser controlada pela mulher, fazem das formulações contendo surfactantes uma opção interessante, que requer um conhecimento mais fundamental sobre os efeitos toxicológicos dos surfactantes e a relação entre a sua estrutura e actividade microbicida. No presente estudo, foram avaliados os efeitos in vitro da concentração de surfactante, do tempo de exposição e da estrutura dos compostos na viabilidade de diferentes tipos de células de mamífero comumente encontradas na mucosa vaginal, nomeadamente, células epiteliais confluentes e completamente polarizadas, células com origem epitelial confluentes mas não polarizadas e células dendríticas. Compostos representativos das diferentes famílias de surfactantes comercialmente disponíveis – não iónicos (Triton X-100 e Monolauril), zwiteriónicos (DDPS), aniónicos (SDS) e catiónicos (CnTAB (n = 10 to 16), C12PB, e C12BZK) – foram estudados. Uma vez que as ISTs bacterianas mais comuns e prevalentes em co-infecções com VIH são causadas por Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoe, ambas bactérias Gram-negativas, o efeito microbicida dos surfactantes catiónicos, os mais promissores de entre os compostos estudados, foi avaliada utilizando Escherichia coli como modelo experimental de uma bactéria Gram-negativa. Os surfactantes Trinton X-100, DDPS e SDS exerceram efeitos tóxicos em todos os tipos de células apenas a concentrações próximas da concentração micelar crítica (CMC), o que sugere um modo de acção não selectivo, envolvendo a desestabilização e/ou destruição da membrana celular. Até uma concentração máxima 10 vezes superior à CMC, o Monolauril não se mostrou tóxico para nenhum dos tipos de células estudados. Todos os surfactantes catiónicos se mostraram tóxicos a concentrações muito inferiores à respectiva CMC, apresentando diferenças significativas quanto a sua toxicidade em células polarizadas e não polarizadas. Anfifilas catiónicas pertencentes à família dos CnTAB, mas diferindo no número de carbonos que constituem a sua cadeia hidrofóbica, mostram uma dependência não linear da sua toxicidade em relação ao tamanho da cadeia alquílica. A toxicidade dos surfactantes também se mostrou dependente da estrutura química do grupo da cabeça polar, sendo que os surfactantes com cabeças polares constituídas por grupos maiores (C12BZK e C12PB) e com carga mais deslocalizada (C12PB) os mais tóxicos. Os resultados também mostram que concentrações de surfactantes próximas da concentração micelar crítica causam toxicidade aguda, enquanto concentrações mais baixas podem conduzir a uma toxicidade persistente pós-exposição, o que sugere um local de acção intracelular. Embora de entre os surfactantes os compostos quaternários de amónio (CQAs) se tenham mostrado como os mais úteis e eficazes enquanto anti-sépticos e desinfectantes, os resultados do estudo toxicológico realizado mostram que estes são também os mais tóxicos para as células de mamíferos. O entendimento dos mecanismos de toxicidade, em particular, a concentrações abaixo da CMC, bem como da sequência de eventos subjacente à morte de células epiteliais induzida pelos surfactantes, é essencial para o desenvolvimento de moléculas mais eficazes e seguras. Neste sentido, os mecanismos responsáveis pela toxicidade induzida pelos surfactantes em células epiteliais polarizadas foram estudados. Os resultados mostram que a disfunção mitocondrial é um evento precoce na toxicidade induzida por surfactantes catiónicos, manifestando-se a concentrações sub-letais, caracterizando-se pela fragmentação das mitocôndrias acompanhada por um decréscimo no estado energético das células a concentrações mais elevadas. Para além disso, os resultados obtidos em fracções mitocondriais isoladas demonstram que todos os compostos testados actuam através de um mecanismo comum que envolve a inibição da NADH-ubiquinona oxidoreductase (Complexo I) e o comprometimento do sistema fosforilativo mitocondrial. A baixas concentrações, as disfunções induzidas por CAQs culminam na apoptose das células, enquanto a exposição das células epiteliais a altas concentrações de surfactantes induz uma mudança da apoptose em favor da necrose. Estes resultados ilustram a importância de incluir uma avaliação rigorosa da função mitocondrial e da citotoxicidade aquando da avaliação de novos compostos candidatos a microbicidas. No que respeita à eficácia antimicrobiana das anfifilas catiónicas contra a Escherichia coli, observou-se que esse efeito é largamente dependente do tamanho da cadeia alquílica, sendo que a a actividade antimicrobiana diminui de forma exponencial com o aumento do tamanho da cadeia alquílica do surfactante. Além disso, contrastando com o que foi observado no caso das células de mamífero, as curvas dose-resposta da toxicidade obtidas apresentam uma forma bifásica. Essas duas fases da curva de toxicidade foram identificadas como dois efeitos distintos dos surfactantes catiónicos, que ocorrem quando diferentes concentrações são atingidas: um efeito bacteriostático a baixas concentrações e um efeito bactericida a concentrações mais altas. Com o aumento da cadeia alquílica, a fracção da contribuição do efeito bacteriostático para a acção antimicrobiana dos CAQs também diminui, danda origem a uma predominância da acção bactericida. Além do mais, tal como no caso das células de mamífero, a eficiência antimicrobiana dos CAQs mostrou-se dependente da estrutura química da cabeça polar, sendo os surfactantes com maiores grupos polares (C12BZK e C12PB) e com a carga positiva mais deslocalizada (C12PB) os mais tóxicos. Foi também observado que as bactérias expostas a baixas concentrações de C10TAB, C12TAB e C12PB, apresentavam alterações morfológicas significativas, tais como anomalias na estrutura da membrana interna e na formação do septo, surgimento de bactérias alongadas e, em alguns casos, descolamento da membrana externa. A maior preocupação no desenvolvimento de microbicidas úteis para o uso clínico na profilaxia das ISTs é a selectividade dos mesmos contra agentes patogénicos. Tendo isto em conta, a especificidade dos efeitos tóxicos dos surfactantes catiónicos foi também analisada através da comparação das curvas de toxicidade obtidas para a E. coli e para as células epiteliais polarizadas de mamífero. Com a excepção do C16TAB, as bactérias revelaram-se mais susceptíveis aos efeitos tóxicos dos surfactantes quando comparadas com as células de mamífero, susceptibilidade essa que provavelmente resulta das diferenças entre a composição lipídica e o potencial de membrana existentes entre as células do agente patogénico e das células do hospedeiro. Os surfactantes catiónicos com cadeias hidrofóbicas curtas (10 ou 12 carbonos), com maiores grupos polares e carga mais deslocalizada apresentaram os índices terapêuticos mais altos, sendo os melhores candidatos para serem utilizados na prevenção de ISTs bacterianas. Ainda que os índices terapêuticos possam ser considerados baixos, tendo em conta as limitações do modelo in vitro usado no caso das células de mamífero, em particular a ausência da produção de muco que pode limitar a absorção dos detergentes, é de esperar que in vivo a toxicidade induzida pelos surfactantes catiónicos nas células da mucosa vaginal seja menor do que aquela aqui descrita. Em conclusão, os resultados apresentados nesta tese contribuem não só para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nos efeitos tóxicos e na actividade microbicida dos surfactantes, como também oferecem uma maior capacidade de prever a segurança de tais compostos, o que pode ser útil para o desenvolvimento de surfactantes mais eficazes e seguros para o uso em aplicações tópicas na profilaxia de ISTs.
Sexually transmitted infections (STIs) are a major public-health problem worldwide. According to the World Health Organization there are 340 million new cases of bacterial and protozoal STIs (Gonorrhea, Syphilis, Chlamydia and Trichomoniasis) per year, a number that does not include the millions of new STIs of fungal (Candidiasis) and viral etiology (Herpes Simplex type 2, Hepatitis B, HPVs and HIV). The direct treatment costs and the serious perinatal collateral damage caused by STIs represent hefty financial and social burdens, particularly in developing countries. Thus, the urgent need for cheap, safe, effective, easy-to-use and easy-to-store woman-controlled topical applications for prophylaxis against STIs makes surfactant-containing formulations an interesting option that requires a more fundamental knowledge concerning surfactant toxicology and structure-activity relationship. In the present work, the in vitro effects of surfactant concentration, exposure time and structure on the viability of mammalian cell types typically encountered in the vaginal mucosa, namely, fully polarized and confluent epithelial cells, confluent non-polarized epithelial-like cells and dendritic cells are reported. Representatives of the different families of commercially available surfactants – nonionic (Triton X-100 and Monolaurin), zwitterionic (DDPS), anionic (SDS), and cationic (CnTAB (n = 10 to 16), C12PB and C12BZK) – were examined. Since the most common and most prevalent in co-infections with HIV bacterial STIs are caused by Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae, both Gram-negative bacteria, the microbicidal effect of cationic surfactants, the most promising ones among the compounds studied, was evaluated using Escherichia coli as Gram-negative bacteria cell model. Triton X-100, DDPS and SDS were toxic to all cell types at concentrations around their critical micelle concentration (CMC) suggesting a non-selective mode of action involving cell membrane destabilization and/or destruction. Up to a concentration of 10 times CMC Monolaurin was not toxic to all cell types. All cationic surfactants were toxic at concentrations far below their CMC and showed significant differences in their toxicity towards polarized as compared with non-polarized cells. Cationic amphiphiles of the CnTAB family, differing in the number of carbons constituting their hydrophobic chain, exhibit a non-linear dependence of their toxicity on the alkyl chain length. Surfactant toxicity was also dependent on the chemical structure of the polar head group, being surfactants with larger polar head groups (C12BZK and C12PB) and more delocalized positive charge (C12PB) the most toxic. The results also show that surfactant concentrations close to the critical micelle concentration cause acute toxicity whereas lower concentrations can lead to a persistent post-exposure toxicity, suggesting an intracellular locus of action. Although, among surfactants, quaternary ammonium compounds (QACs) have been proven to be the most useful antiseptic and disinfectants, the results from the toxicological study performed show that these are also the most toxic for mammalian cells. Understanding the toxicity mechanisms, particularly at concentrations below surfactant CMC, and the sequence of events underlying surfactant-mediated epithelial cell death is crucial for the design and development of more effective and safer molecules. To this end, the mechanisms mediating surfactant-induced polarized epithelial cell toxicity were studied. The results show that mitochondrial dysfunction is an early event in cationic surfactant-induced toxicity, already starting at sub-lethal concentrations, and characterized by mitochondrial fragmentation accompanied by decreased cellular energy charge at higher concentrations. Moreover, the results obtained on isolated mitochondrial fractions demonstrate that all the compounds tested acted by a common mechanism that involves the inhibition of the NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex I) and by hampering the mitochondrial phosphorylative system. For low concentrations, QACs-induced mitochondrial dysfunction culminates in apoptosis, while the exposure of epithelial cells to high surfactant concentration induces a shift from apoptosis to necrosis. These results highlight the importance of including a rigorous assessment of mitochondrial function and cytotoxicity when evaluating new microbicide candidates. Concerning the antimicrobial efficacy of cationic amphiphiles against Escherichia coli, it was found to be greatly dependent on the length of their alkyl chain and to exponentially decrease with the increase in surfactant alkyl chain length. Moreover, distinct from what was observed in the case of mammalian cells, the dose-response toxicity curves were biphasic. These two phases of the toxicity curve were found to correspond to two discrete effects of cationic surfactants which occur at different threshold concentrations: a bacteriostatic action at low concentrations and a bactericidal activity at higher concentrations. With the increase in the alkyl chain length, the fractional contribution of the bacteriostatic effect to the global antimicrobial activity of QACs also decreases, giving rise to a predominant bactericidal action. Furthermore, as in the case of mammalian cells, the antimicrobial efficiency of QACs was also dependent on the chemical structure of the polar head group, with surfactants possessing larger polar head groups (C12BZK and C12PB) and more delocalized positive charge (C12PB) being the most toxic. It was also observed that bacterial cells exposed to low concentrations of C10TAB, C12TAB and C12PB, presented significant morphological alterations, such as anomalies in the inner membrane structure and in the septum formation, emergence of elongated bacterial cells and in some cases, detachment of the outer membrane. The major concern in the development of clinically useful microbicides for STIs prophylaxis is their selective toxicity against the pathogenic agents. With this in mind, the specificity of cationic surfactants toxic effects was also addressed by comparing the toxicity curves obtained for both E. coli and mammalian polarized epithelial cells. With the exception of C16TAB, bacteria were more susceptible to cationic surfactants than mammalian cells, a selectivity that probably results from differences in the lipid composition as well as in the membrane potential between the target pathogen and host cell membranes. Cationic surfactants with short hydrophobic chains (10 or 12 carbons), larger polar head groups and more delocalized charge, presented the highest therapeutic indices, being the best candidates to be used for the prevention of bacterial STIs. Although the therapeutic indices obtained may be considered narrow, in view of the limitations of the in vitro mammalian cell models used, namely the lack of mucus production which might limit surfactants absorption, it is expected that in vivo the toxicity of cationic surfactants towards vaginal mucosa cells will be lower than reported here. In conclusion, the results presented in this thesis not only contribute to the understanding of the mechanisms involved in surfactant toxicity and microbicidal action, but also offer predictive power with regard to their safety, which may be useful in designing more effective and less harmful surfactants for use in topical applications for STI prophylaxis.
Description: Tese de doutoramento em Biociências, no ramo de especialização em Neurociências, sob a orientação da Doutora Otília Vieira, do Professor Doutor Winchil Vaz e da Professora Doutora Emília Duarte, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: https://hdl.handle.net/10316/22672
Rights: openAccess
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