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https://hdl.handle.net/10316/22070
Title: | Pharmacological activation of autophagy in Machado-Joseph disease | Authors: | Ferreira, Ana Cristina Lopes Vasconcelos | Orientador: | Almeida, Luís Pereira de Nóbrega, Clévio David Rodrigues |
Keywords: | Carbamazepina; Doença de Machado-Joseph | Issue Date: | 2012 | Citation: | FERREIRA, Ana Cristina Lopes Vasconcelos - Pharmacological activation of autophagy in Machado-Joseph disease. Coimbra : [s.n.], 2012. Dissertação de mestrado | Abstract: | Machado Joseph disease, or spinocerebellar ataxia type 3, is a hereditary neurodegenerative
disorder with severe clinical features, being the most common autossomal dominant
spinocerebellar ataxia worldwide. This disease is caused by the expansion of the CAG repeat
region in the ATXN3/MJD1 gene, which translates into an expanded polyglutamine tract within
the affected protein ataxin-3. Mutant ataxin-3 becomes prone to misfolding, accumulating as
nuclear and intracellular inclusions and acquires toxic properties, which lead to neuronal
dysfunction and cell death.
The lysosomal-macroautophagy pathway (here termed autophagy) is a major clearance
pathway for the degradation of dysfunctional proteins and organelles and also essential in the
removal of aggregate-prone intracytosolic proteins, such as mutant ataxin-3. Recently, our
group provided evidence of the implication of autophagy in the accumulation of mutant ataxin-3
aggregates and neurodegeneration in Machado-Joseph disease, supporting the idea that
modulation of autophagy might be a suitable strategy to mitigate the disease. The current
pharmacological strategy for upregulating autophagy through inhibition of the mammalian
target of rapamycin (mTor) may lead to complications associated to rapamycin
immunosuppressant activity. Therefore, other pathways should be investigated particularly the
mTor-independent autophagy induction. Recent evidence suggests that carbamazepine (CBZ),
an anticonvulsant and mood-stabilizing drug, signals through phosphoinositol pathway,
lowering inositol and IP3 levels and presumably enhancing the autophagy and the clearance of
aggregate-prone proteins. Given these evidences the main goal of this study was to investigate
the beneficial effects of CBZ in the alleviation of Machado Joseph disease, mediated by its
autophagy-enhancing ability.
For this purpose we used a neuroblastoma cellular model, and two animal models,
respectively a lentiviral-based MJD mouse model and a transgenic mouse model of disease. In
neuroblastoma cells, we found that CBZ mediates a decrease of mutant ataxin-3 levels, by enhancing autophagy, which was detected by increase of a) LC3-positive autophagic vesicles, b)
the ratio of LC3II/LC3I protein levels and c) mRNA expression of LC3. In in vivo experiments,
using the lentiviral-based model, treatment with CBZ resulted in an improvement of
neuropathology indicated by a decrease of the number of mutant ataxin-3 inclusions and of the
volume of the brain region depleted of the darpp-32 marker Moreover, evaluation of the effects
of CBZ in transgenic mice, revealed a decrease of both aggregated and soluble mutant protein,
accompanied by increased levels of mRNA for the autophagy marker LC3 in treated animals.
To examine the effects of long-term use of CBZ on motor coordination and activity profile of
transgenic mice behavioural tests were performed, using the rotarod and activity box tests.
Treated mice presented better performance relative to control mice, travelled increased
distances, spending less time resting and more time moving fast.
Altogether these results suggest that CBZ ability to activate autophagy might be a suitable
therapeutic approach to mitigate Machado-Joseph disease and potentially to other diseases
characterized by misfolding and toxicity of aggregate-prone proteins. A doença de Machado Joseph ou ataxia espinocerebelosa do tipo 3, é uma doença neurodegenerativa hereditária com manifestações clínicas severas, sendo a ataxia espinocerebelosa dominante autossómica mais comum em todo o mundo. Esta doença é causada por uma repetição excessiva do trinucleótido CAG no gene MJD1/ATXN3, que se traduz numa cadeia de glutaminas expandida na proteína afetada, ataxina-3. Devido a esta mutação, a ataxina 3 mutante toma conformações alteradas e adquire propriedades tóxicas, que levam a acumulação de inclusões nucleares e citoplasmáticas, disfunção neuronal e a morte celular. A via lisosomal da autofagia (aqui designada de autofagia) é um importante mecanismo de degradação de proteínas e organelos disfuncionais, e também fundamental na eliminação de proteínas insolúveis com tendência para agregar; como é característico da ataxina-3 mutada nesta doença. Recentemente o nossos grupo apresentou evidências da implicação da autofagia na doença de Machado Joseph, reforçando a ideia que a modulação da autofagia poderá ser uma estratégia viável para mitigar a doença. A estratégia farmacológica de ativação da autofagia recorrendo ao uso da rapamicina e seus análogos, que têm a capacidade de inibir o complexo mTor (mammalian target of rapamycin) tem contra-indicações para tratamentos a longo prazo devido à sua actividade imunossupressora. Desta forma, impõe-se o estudo de outras vias cuja ativação da autofagia seja independente do complexo mTor. Evidências recentes sugerem que a carbamazepina (CBZ), um anticonvulsivo e estabilizador de humor, atua na via de sinalização do fosfoinositol, diminuindo os níveis de inositol e IP3, o que presumivelmente leva à ativação da autofagia e à degradação de proteínas agregadas. Tendo em conta estas evidências, o principal objetivo deste estudo foi investigar os potenciais efeitos benéficos da carbamazepina na atenuação da doença de Machado Joseph. Nesse sentido, recorremos a modelos celulares da doença, bem como ao modelo lentiviral e transgénico no roedor. Nas células de neuroblastoma verificámos que a carbamazepina levou a uma diminuição dos níveis da proteína mutada mediada por autofagia, o que foi detetado pelo aumento do número de vesículas positivas para o marcador de autofagia LC3, do rácio de LC3II/LC3I e pelos níveis aumentados de expressão de LC3. As experiências in vivo, usando o modelo lentiviral, mostraram que o tratamento com CBZ resultou numa melhoria da neuropatologia indicada pela diminuição do número de inclusões de ataxina-3 mutante e de perda de volume do marcador DARPP-32. Para além disso, a avaliação dos efeitos da CBZ em murganhos transgénicos revelou uma diminuição da proteína mutante agregada e solúvel, acompanhada por um aumento da expressão de LC3 nos animais tratados. De forma a avaliar o efeito a longo prazo do uso da CBZ na coordenação motora e perfil de movimento e atividade foram realizados testes de comportamento recorrendo à roda rotativa e caixa de atividade. Os animais tratados apresentaram melhor performance relativamente aos controlos, percorrendo distâncias superiores, permanecendo menos tempo imóveis e mais tempo em movimento rápido. Em suma, estes resultados sugerem que a capacidade da CBZ em ativar a autofagia poderá ser uma abordagem terapêutica viável no tratamento da doença de Machado-Joseph e potencialmente de outras doenças caracterizadas pela acumulação de proteínas agregadas. |
Description: | Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra | URI: | https://hdl.handle.net/10316/22070 | Rights: | openAccess |
Appears in Collections: | UC - Dissertações de Mestrado FFUC- Teses de Mestrado |
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