Genetic imbalances and numerical chromosomal alterations in glioblastomas as assessed by single-nucleotide polymorphism (SNP)-arrays and their impact on gene expression

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM) is by far the most common malignant subtype of glial tumors. Despite implementation of intensive therapeutic strategies and supportive care, the disease invariably leads to death over a short period of time after diagnosis. Despite the inter- and intratumoral heterogeneity of these tumors at the histopathological, genomic and transcriptional levels, at present it is still not possible to identify already at diagnosis, which patients will benefit from different treatment strategies. In turn, the pathogenesis of glioblastoma is still far from being completely understood. Overall, GBM is considered to be a multifactorial disorder, which arises from complex interactions between a variety of genetic and epigenetic alterations, environmental exposure and genetic susceptibility. Accumulative DNA damage responsible for tumor transformation is believed to be due to a multistep process that involves functional inactivation of tumor suppressor genes and DNA repair genes, and/or activation of oncogenes. Multiple studies aimed at identifying genetic alterations in GBM which are involved in tumor development and progression, have been reported in the past. Commonly observed genetic alterations include amplification and/or mutation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) gene, and the mouse double-minute 2 (MDM2) genes, among other genes; in turn, deletion/mutation of tumor suppressor genes, such as the tumor protein p53 (TP53) gene, the phosphatase and tensin homolog (PTEN) and the cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (CDKN2A/p16) genes, has also been frequently reported in these tumors. On top of this, a variety of multiple other numeric chromosomal alterations have been described in glioblastomas; among other, these include trisomy of chromosome 7 and gains of chromosomes 12p, 19q, and 20q, together with deletion of chromosomes 1, 9, 10, and 19. Based on their biological and genetic features, two different subgroups of GBM tumors have been defined which have a distinct ontogeny: the vast majority of GBM present as primary tumors or de novo glioblastomas in older patients without evidence for a less malignant precursor lesion, whereas secondary glioblastoma, slowly progressing from a low-grade glioma in younger patients, is infrequent. EGFR amplification and/or EGFR mutation, deletion of PTEN and p16 are recurrent events in 3 primary glioblastomas, whereas TP53 and IDH1/IDH2 mutations are early and frequent genetic alterations in the pathway leading to secondary GBM. Despite important progress has been made in our understanding of the molecular pathogenesis of primary glioblastoma, no definitive genetic signature exists for this brain neoplasm, and no tumor-specific genetic marker with indubitable prognostic value is currently available. Taken together, these evidences reinforce the need to better understand the mechanisms by which genetic and molecular alterations occur in GBM, as well as their impact on the clinical and biological behavior of the tumor. Recent availability of new highly sensitive high-throughput approaches, such as those based on microarray technology, facilitates the identification of genetic/chromosomal abnormalities occurring in GBM, at the same time they may also contribute to the discovery of new and smaller alterations, which might have not yet been associated with the pathogenesis of the tumor. In the present study, we performed whole-genome DNA analysis using both high-density single nucleotide polymorphism (SNP)-arrays, and massive mRNA analyses of human GBM tumor samples. Our goal focused on the identification of those genes amplified or deleted in primary glioblastoma, and their relationship with specific genetic and gene expression profiles, as well as with disease outcome. In a first step, a group of 35 primary glioblastomas were screened for specific DNA copy number (CN) alterations involving chromosomal regions of gain and loss of gene sequences, using SNP-arrays. At this point, special attention was paid to those genetic alterations of chromosomes 7, 9p and 10q, which were present in virtually every case (97%, 83% and 91% of the cases, respectively). Interphase fluorescence in situ hybridization (iFISH) studies performed in parallel confirmed the high frequency of these alterations as detected by SNP-arrays. Once the alterations detected for these three chromosomes were simultaneously considered, five distinct cytogenetic profiles emerged, which identified distinct prognostic subgroups of glioblastomas. Of note, those tumors displaying EGFR amplification clearly showed a better outcome among older (>60 years old) patients, as confirmed by further multivariate analysis of a larger series (n=119) of primary GBM from public databases. In addition, we determined the precise extension of those critical DNA sequences affected by CN alterations involving chromosomes 7, 9 and 10, and identified the specific genes they contained; such genes 4 are likely to be involved in the pathogenesis and/or malignant transformation of glioblastoma. In the second part of the study, we extended our previous analysis to a total of 46 GBM. Now, we used SNP-arrays to investigate recurrent CN alterations (e.g. amplification and deletions) for all human chromosomes, to identify those genes specifically involved in such alterations, and evaluated the impact of said alterations on the mRNA levels of the involved genes. Overall, recurrent amplicons were detected for chromosomes 7 (50%), 12 (22%), 1 (11%), 4 (9%), 11 (4%), and 17 (4%), while recurrent homozygous deletions involved chromosomes 9p21 (52%) and 10q (22%). Interestingly, most genes which displayed a high correlation between DNA CN values and mRNA levels were coded in the amplified chromosomal regions; by contrast, for the homozygously deleted regions, such correlation was restricted to the methylthioadenosine phosphorylase (MTAP) gene coded at chromosome 9p21. These findings strengthen the presence of novel candidate oncogenes and tumor suppressor genes mapping to regions of amplicons and of chromosome deletion, respectively. In summary, here we show that the combination of high-throughput genomic and transcriptional data is crucial to define recurrent cytogenetic profiles in GBM and differentiate between those genes that show concordant CN alterations and expression patterns and that consequently may have functional relevance in the pathogenesis of glioblastoma, and genes whose alteration does not translate into a different gene expression profile (GEP). Such comprehensive analysis also allowed the identification of new candidate genes as preferential targets for amplification in GBM. Further studies in larger series of patients are required to confirm the potential clinical significance of our findings.

O glioblastoma multiforme (GBM) é o subtipo maligno mais comum de todos os tumores gliais. Apesar da implementação de estratégias terapêuticas intensivas, a doença conduz invariavelmente à morte, num curto período de tempo após o diagnóstico. Apesar da heterogeneidade inter e intratumoral destes tumores a nível histopatológico, genómico e transcripcional, ainda não é possível identificar no momento do diagnóstico, que doentes beneficiarão das diferentes estratégias terapêuticas. Por sua vez, a patogénese destes tumores está longe de ser completamente esclarecida. O GBM é considerado uma doença multifactorial, que surge a partir de interações complexas entre uma variedade de alterações genéticas e epigenéticas, a exposição ambiental e a susceptibilidade genética. Danos cumulativos no ADN, responsáveis pela transformação do tumor, são devidos a um processo sequencial que envolve a inactivação funcional de genes supressores tumorais e de genes de reparação do ADN e/ou a activação de oncogenes. Diversos estudos anteriores focaram a sua investigação na identificação de alterações genéticas que pudessem estar envolvidas no desenvolvimento e progressão do GBM. Alterações frequentes incluem a amplificação e/ou mutação dos genes EGFR, CDK4 e MDM2, entre outros genes; por sua vez, a deleção/mutação de genes supressores tumorais, tais como os genes TP53, PTEN e CDKN2A/p16, são também recorrentes nestes tumores. Múltiplas alterações cromossómicas numéricas foram igualmente descritas em glioblastomas, incluindo entre outras, trissomia do cromossoma 7, ganhos dos cromossomas 12p, 19q, 20q e perdas dos cromossomas 1, 9, 10, e 19. Com base nas características biológicas e genéticas destes tumores, definem-se dois subgrupos de GBM, com diferente ontogenias: a grande maioria dos GBM apresenta-se como tumores primários ou “de novo” em doentes de uma faixa etária superior, sem evidência de uma lesão precursora de menor grau de malignidade, enquanto os GBM secundários são pouco frequentes e progridem lentamente a partir de um glioma de baixo grau, sendo mais comuns em doentes jovens. A amplificação e/ou mutação do gene EGFR e a perda dos genes PTEN e p16 são eventos recorrentes em GBM primários, enquanto as mutações dos genes TP53 e 7 IDH1/IDH2 são alterações genéticas iniciais na progressão para o glioblastoma secundário. Apesar dos progressos no conhecimento sobre a patogénese molecular dos GBM primários, não existe uma assinatura genética definitiva para esta neoplasia cerebral e, actualmente, não existe também nenhum marcador tumoral específico com valor prognóstico claro. Estas evidências reforçam a necessidade de compreender melhor os mecanismos pelos quais as alterações genéticas e moleculares ocorrem no GBM, bem como o seu impacto sobre o comportamento clínico e biológico do tumor. A recente disponibilidade de novas abordagens de grande sensibilidade, resolução e rendimento, tais como a tecnologia de “microarrays”, facilita a identificação de alterações genéticas/cromossómicas que ocorrem nos glioblastomas e, ao mesmo tempo, poderão contribuir para a descoberta de novas alterações que não tenham sido ainda associadas à patogénese do tumor. No presente estudo, procedemos à análise do ADN tumoral utilizando a tec ologia de “SNP-arrays” e à análise massiva do RNAm de amostras tumorais de glioblastomas humanos. O nosso objetivo centrou-se na identificação de genes amplificados ou perdidos no glioblastoma primário, e a sua relação com determinados perfis genéticos e de expressão génica, bem como com a evolução da doença. Na primeira parte deste estudo, realizámos a pesquisa de alterações específicas no número de cópias do ADN, envolvendo regiões cromossómicas de ganho e de perda de sequências genéticas, aplicando a tec ologia de “SNP-arrays” no estudo de 35 glioblastomas primários. Prestámos especial atenção às alterações genéticas observadas nos cromossomas 7, 9p e 10q, presentes em praticamente todos os casos analisados (97%, 83% e 91% dos casos, respectivamente). Os estudos de hibridização in situ fluorescente em núcleos interfásicos (iFISH) realizados em paralelo confirmaram a elevada frequência destas alterações genéticas, anteriormente detectadas por “SNParrays”. Considerando simultaneamente as alterações observadas nestes três cromossomas, identificámos cinco perfis citogenéticos distintos, que reflectiam distintos subgrupos de glioblastomas com um prognóstico diferente. Em particular, os tumores com amplificação de gene EGFR apresentaram claramente um prognóstico mais favorável em doentes com mais de 60 anos, como confirmado pela análise multivariada de uma série maior (n=119) de glioblastomas primários, disponível em 8 9 bases de dados públicas. Determinámos ainda a extensão exacta das sequências de ADN afectadas por alterações do número de cópias dos cromossomas 7, 9 e 10, e identificámos os genes específicos aí contidos, susceptíveis de estar envolvidos na patogénese e/ou transformação maligna do glioblastoma. Na segunda parte do estudo, alargámos a análise anterior a um total de 46 glioblastomas. c t c g d “SNP-arrays” para investigar alterações recorrentes no número de cópias (ex., amplificação e delecção) em todos os cromossomas do genoma, com o objectivo de identificar os genes especificamente envolvidos nestas alterações; posteriormente, avaliámos o impacto das referidas alterações nos níveis de RNAm dos genes implicados. Em geral, as amplificações detectadas com maior frequência foram aquelas que afectaram os cromossomas 7 (50%), 12 (22%), 1 (11%), 4 (9%), 11 (4%) e 17 (4%), enquanto as delecções recorrentes envolveram os cromossomas 9p21 (52%) e 10q (22%). Curiosamente, a maioria dos genes que apresentaram uma elevada correlação entre o número de cópias de ADN e os níveis de RNAm, estavam codificados nas regiões cromossómicas amplificadas; pelo contrário, para as regiões de delecção homozigótica, tal correlação foi restrita ao gene MTAP, codificado no cromossoma 9p21. Estes resultados reforçam a noção da possível presença de novos oncogenes e genes supressores tumorais candidatos, localizados nas regiões de amplificação e delecção cromossómica, respectivamente. Em resumo, neste estudo demonstrámos que a combinação dos resultados obtidos ao nível genómico e transcripcional é essencial para definir perfis citogenéticos recorrentes no glioblastoma, permitindo diferenciar os genes com alterações concordantes entre o número de cópias e os padrões de expressão, podendo assim ter relevância funcional na patogénese do glioblastoma, dos genes cuja alteração não se traduz num perfil de expressão génica distinto. Esta análise abrangente, permitiu ainda a identificação de novos genes, candidatos a alvos preferenciais para a ocorrência de amplificação genética nos GBM. Estudos adicionais em séries mais alargadas serão necessários para confirmar o potencial significado clínico dos nossos resultados.