Regulation of Synapse Composition by Protein Acrylation: the Role of Acetylated Cortactin

Abstract

É aceite pela comunidade científica que alterações na expressão genética poderão estar envolvidas na plasticidade neuronal associada a processos de aprendizagem e memória. De facto, o aumento da acetilação nas caudas de histonas, induzido pelo uso da Trichostatina A (TSA), um inibidor das desacetilases de histonas (HDAC), facilita a potenciação de longa duração (LTP) no hipocampo. Portanto, a desacetilação mediada pelas HDAC funciona como um “interruptor” molecular intranuclear na modulação da actividade sináptica e alterações de longa duração dos circuitos neuronais. Embora o ciclo de acetilação/desacetilação dos resíduos de lisina nas histonas, mediado por acetil-transferases (HATs) e desacetilases, seja um factor obrigatório na regulação da transcrição, outros substratos para essas mesmas enzimas têm vindo a ser identificados ao longo dos últimos anos, sugerindo que a acetilação de proteínas pode modular um grande número de processos além da expressão genética. Neste trabalho abordámos alterações na composição das sinapses excitatórias desencadeadas por alterações do nível de acetilação das proteínas. Os nossos estudos demonstraram que o tratamento de neurónios do hipocampo mantidos em cultura durante 15 dias (15DIV) com TSA, um inibidor das desacetilases do tipo I e II, aumenta a intensidade da fluorescência, área e densidade dos agregados de PSD95, uma proteína pós-sináptica que funciona como regulador principal da força das sinapses excitatórias, e também da Shank, uma proteína âncora pós-sináptica, sem contudo alterar os níveis proteicos totais de qualquer destas proteínas. Por outro lado, a TSA teve um efeito oposto sobre os agregados de cortactina e p140Cap, proteínas relacionadas com o citoesqueleto, cuja área foi diminuída após tratamento com TSA. A intensidade, número, e área dos agregados de gefirina, proteína âncora das sinapses inibitórias e por isso usada como marcador deste tipo de sinapses, não foram alterados em neurónios tratados com TSA, indicando um efeito específico para acetilação de proteínas nas sinapses excitatórias. Os efeitos da inibição das HDAC na plasticidade sináptica e memória, bem como nos componentes moleculares das sinapses excitatórias, podem potencialmente envolver variações no estado de acetilação de outras proteínas para além das histonas. Na verdade, além das histonas, as HDACs e HATs, também possuem outros substratos, sendo um desses substratos a cortactina (Zhang et al., 2007). A cortactina é uma proteína que interage com a F-actina facilitando a nucleação de novos filamentos laterais de actina a partir de filamentos pré-existentes. Nos neurónios, a cortactina encontra-se enriquecida nas espículas dendríticas, as estruturas pós-sinápticas das sinapses excitatórias, desempenhando um papel na sua morfogénese. A depleção da cortactina resulta na redução no número e tamanho das espículas dendríticas, enquanto que a sua sobre-expressão resulta no alongamento das espículas (Hering & Sheng, 2003). Estudos recentes mostraram que a acetilação da cortactina altera a sua capacidade para interagir com a F-actina, regulando a mobilidade celular em células cancerígenas (Zhang et al., 2007), mas a função da acetilação da cortactina em células neuronais é até agora desconhecida. Descobrimos que os níveis de acetilação da cortactina aumentam em neurónios tratados com TSA, e que a cortactina acetilada é redistribuída das espículas para o corpo da dendrite. Tendo em conta o papel da cortactina na morfogénese espicular, testámos se a acetilação da cortactina poderia influenciar a agregação dendrítica de PSD95. Para tal, sobre-expressámos cortactina tipo selvagem, ou mutantes que mimetizam a cortactina acetilada ou desacetilada, em neurónios do hipocampo, e descobrimos que a acetilação da cortactina tem um impacto na regulação da agregação de PSD95, independente da sua função como regulador da dinâmica da actina, uma vez que a sobre-expressão do mutante acetilado alterou a área e intensidade dos agregados de PSD95, mas não teve efeito sobre o número ou tamanho dos agregados de F-actina. Outra observação importante, foi a diminuição dos agregados de PSD95, resultante da depleção de cortactina em neurónios através de RNA de interferência (shRNA), a qual foi resgatada por uma forma insensível ao shRNA da cortactina tipo-selvagem e também por uma forma da cortactina que mimetiza o seu estado acetilado. Tendo em conta que as modificações pós-traducionais funcionam em conjunto a diversos níveis, testámos se a acetilação da cortactina poderia de alguma forma influenciar a sua fosforilação, e descobrimos que a acetilação da cortactina está correlacionada com uma menor fosforilação na tirosina 421. Além disso, determinámos se a acetilação da cortactina está correlacionada com o nível de interação da cortactina com parceiros de interação conhecidos, como p140Cap e Shank1. Sabendo que o factor neurotrófico neuronal (BDNF), neurotrofina conhecida por desempenhar um papel na regulação da estrutura e função das sinapses glutamatérgicas promovendo, por exemplo, a agregação sináptica de PSD95 (Hu et al., 2011; Yoshii and Constantine-Paton, 2007) testámos se o mesmo poderia regular os níveis de acetilação da cortactina. Observámos que o BDNF promove a acetilação da cortactina em neurónios do hipocampo em cultura, e este efeito é dependente da activação das vias de sinalização MEK1/2 e PLCγ. Estas evidências sugerem que o BDNF pode regular a estrutura sináptica, alterando o nível de acetilação da cortactina. Analisados em conjunto, os nossos dados sugerem que a acetilação das proteínas afecta as sinapses excitatórias e que a acetilação reversível da cortactina pode funcionar como um mecanismo atractivo na maturação das sinapses através de uma regulação indiscutivelmente única da agregação dendrítica de PSD95. No entanto, o ciclo de desacetilação/acetilação da cortactina pode também regular o desenvolvimento das espículas através duma possível via distinta, dependente da dinâmica da actina, relacionada com a sua função na promoção da ramificação e alongamento necessários para a formação dos filopodia e consequente “alargamento”. As nossas descobertas desvendam um papel inesperado para a acetilação da cortactina na regulação da agregação dendrítica de PSD95, a qual pode actuar em conjunto com o papel da cortactina no desenvolvimento da espícula dendrítica.

Changes in gene expression are thought to be involved in neuronal plasticity associated with learning and memory. In effect, increased histone-tail acetylation induced by the use of the histone deacetylase (HDAC) inhibitor trichostatin A (TSA) enhances induction of long term potentiation in the hippocampus. Therefore, HDAC-mediated deacetylation functions as an intranuclear molecular switch in the modulation of synaptic activity and longlasting changes of neuronal circuits. Although acetylation/deacetylation of lysine residues on histones by histone acetyltransferases (HAT) and HDACs is an obligatory component of transcription regulation, other substrates of HATs and HDACs have lately been identified, suggesting that protein acetylation can modulate a myriad of processes besides gene expression. Here we addressed alterations in the composition of excitatory synapses triggered by changing the acetylation level of proteins. We show that treatment of hippocampal neurons in culture (15 DIV) with the inhibitor of types I and II histone deacetylase TSA increases the fluorescence intensity, area and density of the clusters for the excitatory postsynaptic protein PSD95, a major regulator of the strength of excitatory synapses, and for the postsynaptic scaffold protein Shank, without changing their total protein levels. Conversely, TSA had an opposite effect on cortactin and p140Cap, cytoskeleton-related proteins which cluster area was decreased by the TSA treatment. The intensity, number or area of the clusters for the inhibitory synaptic marker gephyrin were not altered in neurons treated with TSA, indicating a specific effect for protein acetylation at excitatory synapses. The effects of HDAC inhibition on synaptic plasticity and memory and also on the molecular components of excitatory synapses may potentially involve variations in the acetylation status of proteins other than histones. In fact, in addition to histones, HDACs and HATs target nonhistone proteins, and one characterized nonhistone HDAC substrate is cortactin (Zhang et al., 2007). Cortactin is an F-actin-binding protein which facilitates the nucleation of actin branches on the side of pre-existing filaments of actin. In neurons, cortactin is enriched in dendritic spines, the postsynaptic structures for excitatory synapses, and has a role in spine morphogenesis. Knockdown of cortactin results in depletion of dendritic spines, whereas overexpression of cortactin causes the elongation of spines (Hering & Sheng, 2003). Recent studies showed that cortactin acetylation changes its ability to bind F-actin, and regulates cellular motility in cancer cells (Zhang et al., 2007), but the function of cortactin acetylation in neuronal cells is so far unknown. We found that the cortactin acetylation levels are increased in neurons treated with TSA, and that acetylated cortactin is redistributed from spines to the dendritic shaft. Since cortactin plays a role in the morphogenesis of spines, we tested whether acetylation of cortactin influences the dendritic clustering of PSD95. We overexpressed wild-type cortactin, or the mimetic mutants for acetylated or deacetylated cortactin, in hippocampal neurons, and found that cortactin acetylation has an impact on regulating PSD95 clustering, independent from its function as a regulator of actin dynamics, since overexpression of the cortactin acetylation mutants altered the area and intensity of PSD95 clusters, but had no effect on the number or size of F-actin clusters. Importantly, depletion of cortactin in neurons using shRNA resulted in a decrease on the dendritic clustering of PSD95, which was rescued by a form of wild-type cortactin refractory to shRNA or by the mutant mimicking acetylated cortactin. Since posttranslational modifications work jointly at several levels, we tested whether cortactin acetylation affects its phosphorylation, and found that acetylation of cortactin is correlated with lower phosphorylation of cortactin at tyrosine 421. Additionally, we found that cortactin acetylation is correlated with decreased interaction with known interaction partners, such as p140Cap and Shank1. Since the neurotrophin BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) is known to play a role in the regulation of the structure and function of glutamatergic synapses, for example by promoting the synaptic clustering of PSD95 (Hu et al., 2011; Yoshii and Constantine-Paton, 2007), we tested whether BDNF regulates cortactin acetylation. BDNF promotes the acetylation of cortactin in hippocampal neurons in culture, and this effect is dependent on activation of the MEK1/2 and PLC signaling pathways. These evidences suggest that BDNF may regulate the synaptic structure by changing the acetylation level of cortactin. Taken together our data suggest that protein acetylation affects excitatory synapses, and that reversible acetylation of cortactin may function as an attractive mechanism in synapse maturation through an undoubtedly unique regulation of the dendritic clustering of PSD95. Nevertheless, cortactin acetylation/deacetylation may also regulate spine development through a distinct possible pathway, dependent on actin assembly, which implicates its actin-branching and elongation activity for filopodia formation and outgrowth. Our findings unravel an unsuspected role for cortactin acetylation in the regulation of PSD95 dendritic clustering, which may work in concert with cortactin’s role in spine development.