Please use this identifier to cite or link to this item:
https://hdl.handle.net/10316/20313
Title: | Regulation of Synapse Composition by Protein Acrylation: the Role of Acetylated Cortactin | Authors: | Catarino, Tatiana Andreia Forjaz Amaral | Keywords: | Acetilação; Sinapses | Issue Date: | 25-May-2012 | Citation: | CATARINO, Tatiana Andreia Forjaz Amaral - Regulation of synapse composition by protein acrylation : the role of acetylated cortactin. Coimbra : [s.n.], 2012. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/20313 | Abstract: | É aceite pela comunidade científica que alterações na expressão genética
poderão estar envolvidas na plasticidade neuronal associada a processos de
aprendizagem e memória. De facto, o aumento da acetilação nas caudas de
histonas, induzido pelo uso da Trichostatina A (TSA), um inibidor das
desacetilases de histonas (HDAC), facilita a potenciação de longa duração
(LTP) no hipocampo. Portanto, a desacetilação mediada pelas HDAC funciona
como um “interruptor” molecular intranuclear na modulação da actividade
sináptica e alterações de longa duração dos circuitos neuronais. Embora o ciclo
de acetilação/desacetilação dos resíduos de lisina nas histonas, mediado por
acetil-transferases (HATs) e desacetilases, seja um factor obrigatório na
regulação da transcrição, outros substratos para essas mesmas enzimas têm
vindo a ser identificados ao longo dos últimos anos, sugerindo que a acetilação
de proteínas pode modular um grande número de processos além da
expressão genética. Neste trabalho abordámos alterações na composição das
sinapses excitatórias desencadeadas por alterações do nível de acetilação das
proteínas. Os nossos estudos demonstraram que o tratamento de neurónios do
hipocampo mantidos em cultura durante 15 dias (15DIV) com TSA, um inibidor
das desacetilases do tipo I e II, aumenta a intensidade da fluorescência, área e
densidade dos agregados de PSD95, uma proteína pós-sináptica que funciona
como regulador principal da força das sinapses excitatórias, e também da
Shank, uma proteína âncora pós-sináptica, sem contudo alterar os níveis
proteicos totais de qualquer destas proteínas. Por outro lado, a TSA teve um
efeito oposto sobre os agregados de cortactina e p140Cap, proteínas
relacionadas com o citoesqueleto, cuja área foi diminuída após tratamento com
TSA. A intensidade, número, e área dos agregados de gefirina, proteína âncora
das sinapses inibitórias e por isso usada como marcador deste tipo de
sinapses, não foram alterados em neurónios tratados com TSA, indicando um
efeito específico para acetilação de proteínas nas sinapses excitatórias. Os efeitos da inibição das HDAC na plasticidade sináptica e memória, bem
como nos componentes moleculares das sinapses excitatórias, podem
potencialmente envolver variações no estado de acetilação de outras proteínas
para além das histonas. Na verdade, além das histonas, as HDACs e HATs,
também possuem outros substratos, sendo um desses substratos a cortactina
(Zhang et al., 2007). A cortactina é uma proteína que interage com a F-actina
facilitando a nucleação de novos filamentos laterais de actina a partir de
filamentos pré-existentes. Nos neurónios, a cortactina encontra-se enriquecida
nas espículas dendríticas, as estruturas pós-sinápticas das sinapses
excitatórias, desempenhando um papel na sua morfogénese. A depleção da
cortactina resulta na redução no número e tamanho das espículas dendríticas,
enquanto que a sua sobre-expressão resulta no alongamento das espículas
(Hering & Sheng, 2003). Estudos recentes mostraram que a acetilação da
cortactina altera a sua capacidade para interagir com a F-actina, regulando a
mobilidade celular em células cancerígenas (Zhang et al., 2007), mas a função
da acetilação da cortactina em células neuronais é até agora desconhecida.
Descobrimos que os níveis de acetilação da cortactina aumentam em
neurónios tratados com TSA, e que a cortactina acetilada é redistribuída das
espículas para o corpo da dendrite. Tendo em conta o papel da cortactina na
morfogénese espicular, testámos se a acetilação da cortactina poderia
influenciar a agregação dendrítica de PSD95. Para tal, sobre-expressámos
cortactina tipo selvagem, ou mutantes que mimetizam a cortactina acetilada ou
desacetilada, em neurónios do hipocampo, e descobrimos que a acetilação da
cortactina tem um impacto na regulação da agregação de PSD95,
independente da sua função como regulador da dinâmica da actina, uma vez
que a sobre-expressão do mutante acetilado alterou a área e intensidade dos
agregados de PSD95, mas não teve efeito sobre o número ou tamanho dos
agregados de F-actina. Outra observação importante, foi a diminuição dos
agregados de PSD95, resultante da depleção de cortactina em neurónios
através de RNA de interferência (shRNA), a qual foi resgatada por uma forma
insensível ao shRNA da cortactina tipo-selvagem e também por uma forma da
cortactina que mimetiza o seu estado acetilado. Tendo em conta que as modificações pós-traducionais funcionam em conjunto a diversos níveis,
testámos se a acetilação da cortactina poderia de alguma forma influenciar a
sua fosforilação, e descobrimos que a acetilação da cortactina está
correlacionada com uma menor fosforilação na tirosina 421. Além disso,
determinámos se a acetilação da cortactina está correlacionada com o nível de
interação da cortactina com parceiros de interação conhecidos, como p140Cap
e Shank1. Sabendo que o factor neurotrófico neuronal (BDNF), neurotrofina
conhecida por desempenhar um papel na regulação da estrutura e função das
sinapses glutamatérgicas promovendo, por exemplo, a agregação sináptica de
PSD95 (Hu et al., 2011; Yoshii and Constantine-Paton, 2007) testámos se o
mesmo poderia regular os níveis de acetilação da cortactina. Observámos que
o BDNF promove a acetilação da cortactina em neurónios do hipocampo em
cultura, e este efeito é dependente da activação das vias de sinalização
MEK1/2 e PLCγ. Estas evidências sugerem que o BDNF pode regular a
estrutura sináptica, alterando o nível de acetilação da cortactina.
Analisados em conjunto, os nossos dados sugerem que a acetilação das
proteínas afecta as sinapses excitatórias e que a acetilação reversível da
cortactina pode funcionar como um mecanismo atractivo na maturação das
sinapses através de uma regulação indiscutivelmente única da agregação
dendrítica de PSD95. No entanto, o ciclo de desacetilação/acetilação da
cortactina pode também regular o desenvolvimento das espículas através
duma possível via distinta, dependente da dinâmica da actina, relacionada com
a sua função na promoção da ramificação e alongamento necessários para a
formação dos filopodia e consequente “alargamento”. As nossas descobertas
desvendam um papel inesperado para a acetilação da cortactina na regulação
da agregação dendrítica de PSD95, a qual pode actuar em conjunto com o
papel da cortactina no desenvolvimento da espícula dendrítica. Changes in gene expression are thought to be involved in neuronal plasticity associated with learning and memory. In effect, increased histone-tail acetylation induced by the use of the histone deacetylase (HDAC) inhibitor trichostatin A (TSA) enhances induction of long term potentiation in the hippocampus. Therefore, HDAC-mediated deacetylation functions as an intranuclear molecular switch in the modulation of synaptic activity and longlasting changes of neuronal circuits. Although acetylation/deacetylation of lysine residues on histones by histone acetyltransferases (HAT) and HDACs is an obligatory component of transcription regulation, other substrates of HATs and HDACs have lately been identified, suggesting that protein acetylation can modulate a myriad of processes besides gene expression. Here we addressed alterations in the composition of excitatory synapses triggered by changing the acetylation level of proteins. We show that treatment of hippocampal neurons in culture (15 DIV) with the inhibitor of types I and II histone deacetylase TSA increases the fluorescence intensity, area and density of the clusters for the excitatory postsynaptic protein PSD95, a major regulator of the strength of excitatory synapses, and for the postsynaptic scaffold protein Shank, without changing their total protein levels. Conversely, TSA had an opposite effect on cortactin and p140Cap, cytoskeleton-related proteins which cluster area was decreased by the TSA treatment. The intensity, number or area of the clusters for the inhibitory synaptic marker gephyrin were not altered in neurons treated with TSA, indicating a specific effect for protein acetylation at excitatory synapses. The effects of HDAC inhibition on synaptic plasticity and memory and also on the molecular components of excitatory synapses may potentially involve variations in the acetylation status of proteins other than histones. In fact, in addition to histones, HDACs and HATs target nonhistone proteins, and one characterized nonhistone HDAC substrate is cortactin (Zhang et al., 2007). Cortactin is an F-actin-binding protein which facilitates the nucleation of actin branches on the side of pre-existing filaments of actin. In neurons, cortactin is enriched in dendritic spines, the postsynaptic structures for excitatory synapses, and has a role in spine morphogenesis. Knockdown of cortactin results in depletion of dendritic spines, whereas overexpression of cortactin causes the elongation of spines (Hering & Sheng, 2003). Recent studies showed that cortactin acetylation changes its ability to bind F-actin, and regulates cellular motility in cancer cells (Zhang et al., 2007), but the function of cortactin acetylation in neuronal cells is so far unknown. We found that the cortactin acetylation levels are increased in neurons treated with TSA, and that acetylated cortactin is redistributed from spines to the dendritic shaft. Since cortactin plays a role in the morphogenesis of spines, we tested whether acetylation of cortactin influences the dendritic clustering of PSD95. We overexpressed wild-type cortactin, or the mimetic mutants for acetylated or deacetylated cortactin, in hippocampal neurons, and found that cortactin acetylation has an impact on regulating PSD95 clustering, independent from its function as a regulator of actin dynamics, since overexpression of the cortactin acetylation mutants altered the area and intensity of PSD95 clusters, but had no effect on the number or size of F-actin clusters. Importantly, depletion of cortactin in neurons using shRNA resulted in a decrease on the dendritic clustering of PSD95, which was rescued by a form of wild-type cortactin refractory to shRNA or by the mutant mimicking acetylated cortactin. Since posttranslational modifications work jointly at several levels, we tested whether cortactin acetylation affects its phosphorylation, and found that acetylation of cortactin is correlated with lower phosphorylation of cortactin at tyrosine 421. Additionally, we found that cortactin acetylation is correlated with decreased interaction with known interaction partners, such as p140Cap and Shank1. Since the neurotrophin BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) is known to play a role in the regulation of the structure and function of glutamatergic synapses, for example by promoting the synaptic clustering of PSD95 (Hu et al., 2011; Yoshii and Constantine-Paton, 2007), we tested whether BDNF regulates cortactin acetylation. BDNF promotes the acetylation of cortactin in hippocampal neurons in culture, and this effect is dependent on activation of the MEK1/2 and PLC signaling pathways. These evidences suggest that BDNF may regulate the synaptic structure by changing the acetylation level of cortactin. Taken together our data suggest that protein acetylation affects excitatory synapses, and that reversible acetylation of cortactin may function as an attractive mechanism in synapse maturation through an undoubtedly unique regulation of the dendritic clustering of PSD95. Nevertheless, cortactin acetylation/deacetylation may also regulate spine development through a distinct possible pathway, dependent on actin assembly, which implicates its actin-branching and elongation activity for filopodia formation and outgrowth. Our findings unravel an unsuspected role for cortactin acetylation in the regulation of PSD95 dendritic clustering, which may work in concert with cortactin’s role in spine development. |
Description: | Tese de doutoramento em Biologia, na especialidade de Biologia Celular, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra | URI: | https://hdl.handle.net/10316/20313 | Rights: | openAccess |
Appears in Collections: | FCTUC Ciências da Vida - Teses de Doutoramento |
Files in This Item:
File | Description | Size | Format | |
---|---|---|---|---|
tese final.pdf | 17.29 MB | Adobe PDF | View/Open |
Page view(s)
265
checked on Oct 15, 2024
Download(s)
178
checked on Oct 15, 2024
Google ScholarTM
Check
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.