Generation of a reporter system for monitorization of endothelial differentiation

Abstract

Stem cell differentiation into endothelial cells has been an active field of research within the last years. The increased interest in this research field is a consequence of the huge clinical relevance of these cells and the associated future regenerative medicine treatments that could improve the recovery of pos-ischemic conditions and other angiogenic related states. Despite this increase in research, nowadays the differentiation strategies into the endothelial lineage are very inefficient. This inefficiency is related both to the lack of information regarding the ideal cell source to the differentiation process and to the nonstandardization of the in vitro conditions to induce the endothelial lineage commitment (growth factors, matrices, cytokines). Therefore strategies that permit a real time monitorization of the differentiation process, like viral transduction of tagged DNA, is a reliable and efficient way to evaluate these kinds of processes. In this context, the main aim of this project was to generate a lentiviral tool specific for detecting the expression of an endothelial late marker (vascular endothelial-cadherin – VEcadherin). This objective was accomplished through the ligation of the VE-cadherin promoter and a mCherry fluorescent tag. After generating the reporter system, the validation of this tool was done by infecting human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). The results show that 5 days after infection HUVECs present an increased pattern of red fluorescence and no alteration was observed within the infected iPSCs. There is already on-going work to differentiate the infected iPSCs and monitor the red fluorescence levels. Additionally, some information was generated regarding the internalization of organic nanoparticles (NPs) and adhesion and proliferation of iPSCs in possible endothelial inductive substrates. The results show that the iPSCs are able to internalize nanoparticles even when the NPs are adhered to the substrate. In conclusion, the results show the successful creation of a lentiviral construct that permits the direct monitorization of expression of mCherry associated with VE-cadherin promoter. In the future this might be a powerful tool either to be used in a stem cell context or to explore other cell sources and processes like transdifferentiation.

O conhecimento na área da diferenciação de células estaminais na linhagem endotelial tem registado, nos últimos anos, um crescimento muito acentuado. Este fenómeno surge quer em consequência da relevância das células endoteliais na prática clínica, quer do potencial que, por esse motivo, representam enquanto fonte celular para uso em técnicas de medicina regenerativa, como por exemplo, na recuperação de condições como a isquémia. No entanto, apesar da diferenciação endotelial constituir uma área activa de pesquisa, este processo continua a ser ineficiente). A baixa eficiência dos processos de diferenciação endotelial está associada com a falta de estandardização do processo, tanto quanto ao tipo de células a diferenciar, bem como as condições de cultura (factores de crescimento, citocinas, matrizes extracelulares). Com o intuito de desenvolver metodologias para colmatar esta lacuna, têm sido desenvolvidos sistemas virais que permitem a monitorização da expressão de genes de interesse.) Neste contexto, o objectivo central deste projecto foi o desenvolvimento de uma ferramenta lentiviral que permitisse a monitorização da expressão da vascular-endothelial cadherin (VEcadherin) (marcador endotelial tardio). Na construcção deste sistema lentiviral, o promotor da VE-cadherin foi associado a uma porção de DNA codificante para uma proteína fluorescente vermelha (mCherry). A validação desta ferramenta foi efectuada com infecção de human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) e em células estaminais de pluripotência induzida (iPSCs). Os resultados relativos a estas infecções mostram que, 5 dias após a infecção, as HUVECs apresentam uma alteração positiva a nível da fluorescência vermelha e nenhuma alteração foi registada a nível das iPSCs infectadas. Neste momento está em curso a diferenciação das iPSCs infectadas e os níveis de fluorescência estão a ser monitorizados. Adicionalmente, foram gerados alguns dados relativos à internalização de nanopartículas orgânicas (NPs) e adesão e proliferação de iPSCs em matrizes extracelulares com potencial indutor para diferenciação endotelial. Resultados preliminares mostram que as iPSCs são capazes de internalizar as NPs mesmo quando estas se encontram aderidas ao substrato. Sumariamente, os resultados mostram que a geração do sistema lentiviral desejado foi atingida com sucesso. Assim, futuramente, esta ferramenta poderá mostrar-se extremamente útil na monitorização da diferenciação endotelial utilizando diferentes contextos extracelulares (factores de crescimento, citocinas, matrizes) e utilizando diferentes fontes de células. Acresce que esta ferramenta poderá não abranger apenas o contexto de células estaminais mas também expandir-se para outras populações celulares e estudar nomeadamente processos de transdiferenciação.