Actividade e regulação de diferentes tipos de fosfohidrolases em microssomas de raízes de milho

Abstract

Foram isoladas três fracções membranares de células de raízes de milho (Zea mays, L.), cujas membranas foram identificadas por marcadores enzimáticos: a fracção de microssomas leves (F16), essencialmente constituída por membranas de retículo endoplasmático e do sistema de Golgi; a fracção intermédia (F34), enriquecida em tonoplasto; e a fracção mais densa (F40), rica em membrana plasmática. Analisámos a actividade e regulação de fosfohidrolases, essenciais ao metabolismo celular; fizemos a caracterização do transporte de protões dependente de ATP; e distinguimos dois mecanismos diferentes de transporte de Ca2+ através da membrana plasmática. A actividade de ATPase da F40 foi inibida por vanadato, a ATPase da F34 foi inibida por nitrato, e a ATPase da F16 foi estimulada por sulfato. Os parâmetros cinéticos revelaram semelhanças, com Km(ATP)~100-200 µM e Vmax~100-180 nmol ATP /mg proteína. min. A energia de activação (Ea) é 16-17 kcal/mol e a temperatura óptima cerca de 50oC. Todavia, em meio com sulfato em vez de cloreto, a Ea da ATPase da F16 desceu para 12,5 kcal/mol e a enzima tornou-se mais resistente à temperatura (óptimo a 54oC). A (F16) tem actividade de pirofosfatase (PPase) distinta da ATPase, mas o pirofosfato mostrou acção moduladora sobre a ATPase. A PPase é neutra e muito sensível a molibdato. Inversamente a PPase vacuolar (F34) é uma enzima alcalina e insensível a molibdato. A actividade de IDPase (F16) foi fortemente estimulação (200-500%) na presença de detergentes ou após armazenamento no frio (0-4oC). No estado nativo, a enzima não segue a cinética de Michaelis-Menten e apresenta um elevado Km(IDP)~900 µM, enquanto que, na presença de Triton X-100, a curva de saturação é hiperbólica e a enzima torna-se maximamente activa, com maior afinidade para o substrato (Km(IDP)~420 µM). Por outro lado, a acção do detergente reduziu a variação na energia de activação a 10oC e eliminou efeitos cooperativos, como se verificou por análises de Arrehnius e de Hill, respectivamente. Estes resultados revelaram que a IDPase gólgica é regulada alostéricamente, em que ATP e adenosina funcionam como moduladores negativos e IDP como modulador positivo. As três fracções estudadas têm bombas protónicas dependentes de ATP. As H+-ATPases de «RE-Golgi» (F16) e de membrana vacuolar (F34) geram um gradiente transmembranar de protões (?µH+) pouco sensível a vanadato e inibido por sulfato, nitrato e NEM. Observou-se um efeito directo do Cl-, mais acentuado para a F16 que poderá relacionar-se com uma entrada específica deste anião. Relativamente à membrana plasmática (F40), o transporte de H+ foi inibido por vanadato e estimulado por nitrato, tendo sido mais sensível a trinitrobenzenesulfonato e a pH 7,7, em comparação com os resultados das vesículas «RE-Golgi», menos sensíveis a estes factores. Assim, a fracção «RE-Golgi» (F16) revela uma H+-ATPase do tipo V, distinta da H+-ATPase do tipo P de membrana plasmática. As vesículas da membrana plasmática (F40), quando em presença de ATP, libertam H+ intravesicular após adição de cálcio (Ca2+). Cerca de 30% da acumulação de Ca2+ dependente de ATP é sensível ao protonóforo CCCP e corresponde à reducção do Ca2+ acumulado num meio com sulfato em vez de cloreto. Verificámos que a acumulação de Ca2+ dependente do gradiente de protões aumenta fortemente (de 30 para 70%) para elevadas concentrações de Ca2+ (50-250 µM) e tem um pH óptimo próximo de 6,6. A acumulação de Ca2+ insensível a CCCP tem maior afinidade para o Ca2+ e um pH óptimo diferente (pH~7,2). Estes resultados indicam que a membrana plasmática de raízes de milho contem dois mecanismos de transporte de Ca2+: uma «bomba» de Ca2+ de alta afinidade, independente do gradiente de protões e um sistema «antiporta» Ca2+/H+, de baixa afinidade, depende do gradiente de protões.