Chracterization and quantification of systemic changes as undicators of tumor progression : chronic lymphocytyc leukemia

Abstract

A Leucemia Linfocítica Crónica (LLC) é um tumor hematológico de células B maduras e é o tipo de leucemia com maior prevalência nos países ocidentais. Esta leucemia caracteriza-se por uma acumulação de pequenos linfócitos B maduros no sangue e na medula óssea, mas que também pode infiltrar os gânglios linfáticos, o fígado e o baço. Os sintomas habitualmente apresentados nesta patologia são fadiga, anemia hemolítica auto-imune, infecções, espleomegália, hepatomegália e adenopatias, no entanto, a maioria dos doentes são assintomáticos (WHO classificativo, 2008). O diagnóstico da LLC faz-se com base numa contagem de linfócitos B ≥ 5x109/L no sangue. Imunofenotipicamente apresenta uma expressão positiva de CD5, CD19, CD22 e níveis baixos de CD20 e CD79b (Cramer and Hallek, 2011). Esta doença classifica-se em diferentes grupos de prognóstico com base nos sistemas de classificação por estadios de Rai (Rai et al., 1975) ou Binet (Binet et al., 1981). A classificação de Rai começa no estadio 0 e termina no estadio IV, enquanto que a classificação de Binet começa no estadio A e termina no estadio C e foi esta a utilizada neste estudo para classificar os doentes. Sendo que ao estadio A de Binet corresponde o estadio 0 de rai, ao estadio B os estadios I e II e ao estadio C o estadio II e IV (Cramer and Hallek, 2011). A LLC tem um comportamento bastante heterogéneo podendo ir de um bom prognóstico quando o doente se encontra num estadio indolente da doença e não necessita de tratamento até um mau prognóstico no qual a doença se manifesta de forma agressiva e é necessário recorrer a tratamentos. Esta doença pode passar rapidamente de um estadio indolente para um estadio mais agressivo, o que torna imperativo que se estabeleçam factores de prognóstico viáveis e credíveis que possam ajudar na classificação dos diferentes estadios em que os doentes se encontram. Segundo a OMS (Organização mundial de saúde) a LLC e o linfoma linfocítico de células B (um linfoma não-Hodgkin) são diferentes manifestações clinicas da mesma doença. A designação de linfoma aplica-se quando há ocorre um aumento do tamanho dos linfócitos B e da proliferação celular, infiltração da medula óssea e/ou de gânglio linfáticos e desaparece a Linfocitose apresentando uma redução do numero de linfócitos para < 5x109/L no sangue. Com a finalidade de melhor compreender e tentar encontrar novos factores de prognóstico de forma a melhor definir os diferentes estadios da LLC, o principal objectivo deste estudo foi definir processos moleculares e celulares que permitam prever a progressão da LLC. Tendo como objectivos específicos relacionar a percentagem de células leucémicas com a percentagem de células que têm origem na medula óssea e com os diferentes estadios da doença recorrendo à citometria de fluxo. Relacionar os diferentes estadios da doença com níveis circulantes de factores angiogénicos (VEGF) e quimiotácticos (SDF-1), medidos com kits de ELISA, presentes no plasma do sangue de doentes com LLC e linfoma linfocítico. Para além disso pretende-se caracterizar a nível molecular as células leucémicas presentes no sangue periférico dos doentes através de técnicas de PCR quantitativo. De forma a analisar a expressão de genes anti-apoptóticos (BCL-2 e MCL-1), de membros da via Notch (Jagged2 e HEY-2) e de miRNAs presentes nas células mononucleadas destes doentes e os níveis de miRNAs circulantes no plasma do doentes. As amostras de sangue periférico utilizadas neste estudo são de doentes com LLC e linfoma linfocítico que nunca tinham sido tratados e foram obtidas com o consentimento informado dos doentes, segundo as regras do IPOLFG. O primeiro parâmetro analisado neste estudo foi a percentagem de diferentes populações celulares que têm origem na medula óssea e a sua relação com a percentagem de células leucémicas nas amostras de sangue dos doentes com LLC e linfoma linfocítico. Verificou-se que existem mais células leucémicas em circulação nos estadios mais agressivos da doença. No entanto, devido ao reduzido número de amostras não foi possível alcançar resultados relevantes estatistiscamente entre as diferentes varáveis. Em geral, o aumento de células leucémicas em ciurculação relaciona-se com o aumento das células com origem na medula óssea. Os segundos parâmetros estudados foram os níveis circulantes de VEGF e SDF-1 no plasma obtido das amostras de sangue dos doentes. O VEGF é um factor angiogénico que desempenha um papel importante na LLC, neste estudo verificou-se um aumento dos níveis de VEGF no estadio menos agressivo da LLC (estadio A). Estes resultados estão de acordo com os resultados descritos por Molica et al. (2002). Quanto ao SDF-1 é um factor quimiotáctico envolvido na mobilização das células leucémicas da LLC através da corrente sanguínea. Os resultados obtidos neste estudo mostraram um aumento dos níveis de SDF-1 nos doentes comparativamente aos controlos saudáveis, o que coincide com os dados publicados por Barretina et al. (2003). O terceiro parâmetro estudado foi a expressão de genes anti-apoptóticos, o BCL-2 e o MCL-1. As células leucémicas da LLC são células com resistência à apoptose, aumentando assim a sua capacidade de sobrevivência. Por isso é importante estudar o papel da apoptose nestas células. Neste estudo observou-se um aumento da expressão do BCL-2 e do MCL-1 nas amostras de LLC quando comparadas com as amostras de linfoma linfocítico. O quarto parâmetro estudado foi a expressão de membros da via Notch, Jagged2 e HEY-2, uma vez que esta via desempenha um papel na patogénese da LLC, como foi recentemente publicado (Rosati et al., 2009). Neste estudo verificou-se um aumento da expressão do Jagged 2 nas amostras de linfoma linfocítico e nos estadios mais agressivos da doença (estadios B e C), enquanto que a expressão do HEY-2 não revelou diferenças significativas entre os estadios da doença. Os últimos parâmetros estudados foram a expressão de vários miRNAs (microRNAs) miR-155, miR-15a and miR-16-1, miR-21, miR-101, miR-223, miR-221, miR-34a, miR-34c, miR-141, miR-210, miR-942 e miR-380, nas células mononucleadas isoladas do sangue dos doentes e os níveis destes miRNAs circulantes no plasma dos doentes. De todos estes, destacam-se os miR-942, miR-380 e miR-101 pela sua capacidade de distinção entre a LLC e linfoma linfocítico, quando são detectados no plasma. Estando os níveis deste miRNAs circulantes aumentados na amostras de LLC. Em conclusão, os resultados deste estudo sugerem que podem ser usados diferentes marcadores celulares e moleculares para classificar doentes com LLC em diferentes estadios. Esclarecendo um pouco os complexos processos moleculares entre diferentes genes e vias de sinalização, que em conjunto contribuem para a progressão desta doença maligna e fatal.

Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is a mature B-cell malignancy characterized by the accumulation of small B lymphocytes with mature appearance and peripheral blood (PB) and bone marrow (BM) are usually involved. CLL is classified into prognostic groups, some patients could have an indolent disease, while other patients could develop an aggressive disease that requires early therapy. Among these prognostic groups, CLL and SLL are different clinical manifestations of the same disease according to World Health Organization (WHO). Because of that, it is important to establish molecular or cellular criteria (biomarkers) that allow predicting patient staging or progression. For this purpose, we used several techniques and molecular approaches, as follows: flow cytometry to classify the disease stages using well established markers; the same technique was used to detect and quantify circulating Bone marrow-derived cells; circulating angiogenic Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and chemotactic Stromal cell-Derived Factor-1 (SDF-1) factors were quantified by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA); apoptosis-related and notch pathway-related genes and microRNA signatures were obtained and quantified using quantitative real time Polymerase Chain Reaction (qPCR). In this study it was found that there are more leukemic cells in circulation in more aggressive stages of CLL. The reduced patient number did not allow reaching statistical significance (or correlations) between the different variables, although there were several tendencies. In general, the presence of increased circulating leukemia cells correlated with the presence of bone marrow-derived progenitors and with VEGF levels, for instance. The anti-apoptotic genes, B-cell Lymphoma 2 (BCL-2) and myeloid cell leukemia sequence 1 (MCL-1) showed increased expression in CLL patients. The more aggressive stages of CLL showed increase BCL-2, suggesting that these cells have a higher resistance to apoptosis. However this was not observed with MCL-1, where no difference was observed between CLL stages. The Notch ligand Jagged2 showed a higher expression in SLL and in more aggressive stages of CLL which suggested its expression may be associated with aggressiveness and resistance to apoptosis. The levels of circulating miRNAs miR-210, -380 and -101 (plasma-derived) could discriminate between CLL and SLL, being higher in CLL patients. With the results presenting in the current study, it was also possible establish different profiles using circulating miRNAs expression between the less and more aggressive stages of CLL. Taken together, our results suggest different cellular and molecular markers may be used to classify (and stratify) CLL patients at different stages, and more importantly, shed some light into the complex molecular cross-talk between different gene and signaling pathways, which together contribute towards the onset progression of this malignant and fatal disease.