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Title: Cationic Nanoparticles: Friend or Foe? Deciphering the mechanisms of cell death induced by cationic nanoparticles
Authors: Bexiga, Mariana Godinho 
Orientador: Almeida, Luís Pereira de
Keywords: Nanopartículas
Issue Date: 22-Feb-2012
Citation: BEXIGA, Mariana Godinho - Cationic Nanoparticles: Friend or Foe? Deciphering the mechanisms of cell death induced by cationic nanoparticles. Coimbra : [s.n.], 2012
Abstract: Humans come into contact with nanoparticles in all aspects of their daily lives: in food, clothing, cosmetics and pollution. Despite this, the knowledge of how nanoparticles interact with cells is still very scarce, and therefore there are genuine concerns surrounding the application of nanotechnology to humans. Many of the therapeutically appealing nanoparticles display a positive charge at their surface, as this increases their interactions with the negatively charged plasma membrane and with nucleic acids. In addition, studies carried out on people living in highly polluted areas have shown a high incidence of deposition of nanoparticles in the brain which in turn often displayed various inflammatory and neurodegenerative signs typical of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases, thereby prompting questions over possible nanoparticle-induced pathologies. In this work, the mechanisms by which cationic nanoparticles interact with cells, in particular with astrocytes, the most abundant cell type of the central nervous system, have been addressed. An array of molecular and biochemical tools have been applied in the context of a model system composed of 50 nm polystyrene amine-modified positively-charged nanoparticles and an astrocytoma cell line – 1321N1. Investigation of various markers of apoptosis revealed that cells incubated with the amine-modified nanoparticles were dying by apoptosis in a concentration- and time-dependent manner. Studies with polystyrene nanoparticles of the same size but displaying a negative surface charge did not show any toxicity to the cells, indicating that the observed effect was due to the positive charge. The signalling pathway of apoptosis that was being induced in the 1321N1 cells treated with the amine-modified nanoparticles was studied in detail using classical biochemical techniques such as Western blotting, and modern molecular techniques such as RNA interference. Together these studies revealed that the intrinsic pathway of apoptosis was being activated upon incubation of cells with nanoparticles. This was mediated through the formation of the apoptosome by APAF1, caspase 9 and cytochrome c, and was regulated through proteins of the BCL-2 family, namely BAX and BAK, which were in turn activated by BIM, BID and PUMA. In cells treated with nanoparticles, an increase in the expression of several pro-apoptotic genes – PUMA, NOXA and BIM – was also observed. Further analyses revealed that nanoparticles became concentrated in lysosomes, which in turn became susceptible to rupture, releasing their contents into the cytosol with potentially devastating effects to the cell. Mitochondria were also found to be severely damaged, with a loss of their normal architecture and function. Production of reactive oxygen species, a source of oxidative stress to the cell, was also detected, thus confirming the impairment of mitochondrial function. This study also investigated the role of two cellular adaptive pathways, namely autophagy and the endoplasmic reticulum stress response, in response to nanoparticle internalisation. Both of these processes function to help the cell overcome a stressful event, but if they fail, the cell can be driven into apoptosis. In the system under study, both mechanisms were shown to occur, although further studies will be needed in order to fully understand their relevance to the death mechanism elicited by the amine-modified nanoparticles in 1321N1 cells. A final objective of this work was to evaluate the use of RNA interference technology as an approach to the study of the interactions between nanoparticles and cells. The successful demonstration of this method, and its use in deciphering the apoptosis machinery molecules relevant to nanoparticle-induced cell death, indicates that this methodology is likely to rapidly lead to a deeper understanding of the field. The work presented here provides only the beginning of our understanding of how cationic nanoparticles interact with the cellular machinery and induce cytotoxicity, however, it marks one important step to the further development of nanotechnology as a safe technology for application in therapeutics.
O Ser Humano encontra-se em contacto com nanopartículas em todos os aspectos da sua rotina: na alimentação, vestuário, cosméticos e poluição. Apesar disto, o conhecimento sobre o modo como as nanopartículas interagem com as células ainda é bastante escasso havendo, por isso, preocupações genuínas em torno da aplicabilidade da nanotecnologia ao Ser Humano. Muitas das nanopartículas apelativas para aplicação terapêutica possuem uma carga de superfície positiva, pois tal aumenta a interação entre elas e a membrana plasmática que apresenta uma carga negativa, bem como com ácidos nucléicos. Adicionalmente, estudos realizados em habitantes de áreas extremamente poluídas demonstraram uma grande incidência na acumulação de nanopartículas no cérebro que, por sua vez, apresentavam vários sintomas de inflamação e de neurodegeneração típicos das doenças de Alzheimer e Parkinson, o que levantou questões sobre possíveis patologias induzidas pelas nanopartículas. Neste trabalho foram abordados os mecanismos de interacção entre as nanopartículas e células, em particular com astrócitos que são o tipo celular mais abundante no sistema nervoso central. Uma série de técnicas bioquímicas e de biologia molecular foram aplicadas no contexto de um sistema modelo composto por nanopartículas de poliestireno de 50 nm modificadas com grupos amínicos à superficie que lhes conferiam carga positiva e uma linha celular de astrocitoma – 1321N1. A investigação de vários marcadores da apoptose revelou que células incubadas com as nanopartículas aminadas morriam por apoptose de uma forma dependente tanto da concentração como do tempo de incubação. Estudos realizados com nanopartículas de poliestireno de tamanhos semelhantes mas com carga negativa não revelaram qualquer toxicidade para as células, indicando por isso, que o efeito observado era devido à carga positiva das nanopartículas. A via de sinalização de apoptose que estava a ser induzida nas células 1321N1 tratadas com as nanopartículas aminadas foi estudada em detalhe usando técnicas bioquímicas como Western blot, bem como técnicas de biologia molecular moderna como a interferência de RNA. Combinando os resultados destes estudos foi revelado que após incubação das células com as nanopartículas o mechanismo de apoptose era mediado pela activação da via de sinalização intrínseca. Esta ocorria com a formação do apoptosoma pelas proteínas APAF1, caspase 9 e citocromo c e era regulada por proteínas pertencentes à família da BCL-2, nomeadamente BAX e BAK, que eram por seu turno activadas por BIM, BID e PUMA. Em células tratadas com nanopartículas, também foi observado um aumento da expressão de vários genes pro-apoptóticos, em particular PUMA, NOXA e BIM. Outras observações revelaram que as nanopartículas se concentravam nos lisossomas tornando-os susceptíceis a ruptura libertando, desse modo, o seu conteúdo para o citoplasma acarretando efeitos potencialmente devastadores para a célula. Danos severos foram também observados nas mitocôndrias, que perderam a morfologia e actividade normais. A produção de espécies reactivas de oxigénio, uma fonte de stress oxidativo para as células, foi também detectada confirmando deste modo a destruição da função mitocondrial. Este estudo também investigou o papel de duas vias celulares de adaptação, nomeadamente autofagia e a resposta do stress do retículo endoplasmático, em resposta à internalização das nanopartículas. Ambos os processos funcionam de forma a que a célula ultrapasse um evento traumatizante, mas que se falham podem fazer com que a célula morra por apoptose. No sistema em estudo foi demonstrada a ocorrência de ambos os mecanismos, no entanto, estudos mais detalhados têm de ser realizados de modo a compreender a sua relevância para o mecanismo de morte celular induzido pelas nanopartículas aminadas nas células 1321N1. Um último objectivo deste trabalho era avaliar a utilização da tecnologia de interferência de RNA como abordagem ao estudo das interacções entre nanopartículas e células. A demonstração bem sucedida deste método e do seu uso na elucidação dos componentes da maquinaria apoptótica relevantes para a morte celular induzida por nanopartículas, indica que esta metodologia poderá levar rapidamente a uma maior compreensão desta área. O trabalho aqui apresentado constitui apenas o início da compreensão de como nanopartículas catiónicas interagem com a maquinaria celular e como induzem citotoxicidade, marcando no entanto, um passo importante no desenvolvimento da nanotecnologia como uma tecnologia de aplicação terapêutica segura.
Description: Tese de doutoramento em Bioquímica, na especialidade de Biologia Molecular, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/18398
Rights: closedAccess
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