Endoplasmic reticulum stress during amyloid β peptide-induced cell death : role of mitochondria and glutamatergic N-methyl-D-aspartate receptors

Abstract

A doença de Alzheimer é a patologia neurodegenerativa mais prevalente em idosos, afetando quase 35 milhões de pessoas em todo o Mundo. Trata-se de uma doença crónica e progressiva caracterizada por perda de memória e declínio cognitivo devido à perda sináptica e neuronal no hipocampo e córtex cerebral. Nos últimos anos fizeram-se progressos consideráveis com o intuito de compreender melhor a patogénese da doença de Alzheimer, contudo este conhecimento não foi ainda traduzido em fármacos novos e eficazes. Atualmente, apenas duas classes de medicamentos estão disponíveis para o tratamento sintomático da doença de Alzheimer, mas estes apenas apresentam benefícios clínicos modestos em termos de melhoria das capacidades cognitivas e infelizmente não previnem a progressão da doença. A deposição anormal do peptídeo beta-amilóide (Aβ) no cérebro de doentes de Alzheimer sugere que este desempenha um papel crucial na patogénese da doença. Apesar das espécies fibrilares serem há muito tempo consideradas como mediadoras dos seus efeitos neurotóxicos, foi demonstrado recentemente que oligómeros solúveis do Aβ (AβO) são as principais espécies responsáveis pelas alterações a nível sináptico e neuronal na doença de Alzheimer. De acordo com estas descobertas, a “hipótese da cascata de amilóide” previamente proposta foi reformulada e considera agora que os AβO são responsáveis pelas alterações cerebrais que ocorrem durante a fase inicial da doença, conduzindo à demência. Assim, prevenir a formação ou a toxicidade destes AβO poderá ser a chave definitiva para travar a progressão da doença de Alzheimer. Com este estudo pretendeu-se ampliar os conhecimentos sobre os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos lesivos desencadeados pelo Aβ, focando-nos no seu papel como indutor de “stress” do retículo endoplasmático (RE). Especificamente, foi investigado: i) a comunicação entre o RE e a mitocôndria durante a morte celular induzida por Aβ e ii) o papel dos recetores glutamatérgicos N-metil-D-aspartato (NMDARs), em particular das suas subunidades NR2A e NR2B, como um mecanismo desencadeador de “stress” do RE induzido pelo Aβ. Na primeira parte deste trabalho (capítulo 4), usámos uma linha celular ρ0 depletada do seu ADN mitocondrial e caracterizada pela ausência de mitocôndrias funcionais, para demonstrar que a morte celular por apoptose mediada pelo “stress” do RE induzido pelo Aβ ocorre através de um mecanismo dependente da mitocôndria. Mostrámos que a isoforma Aβ1−40 do peptídeo Aβ aumenta os níveis do chaperone GRP78 e ativa a caspase-4, dois marcadores do “stress” do RE, depletando também as reservas de Ca2+ neste organelo, não apenas em células ρ0 mas também nas células parentais ρ+. No entanto, observámos que somente em células ρ+ tratadas com Aβ1−40 ocorre um aumento dos níveis de GADD153/CHOP, um fator de transcrição ativado sob condições de “stress” do RE, ativação de caspase-9 e -3 e aumento do número de células apoptóticas marcadas positivamente para TUNEL. Com o objetivo de investigar melhor a interação mitocôndria/RE na patogénese da doença de Alzheimer, usámos células cíbridas que recriam o defeito na actividade da citocromo c oxidase (COX) mitocondrial detetado em plaquetas de doentes de Alzheimer esporádicos (capítulo 5). Mostrámos que a disfunção mitocondrial resultante da inibição da COX afeta a resposta ao “stress” do RE e subsequente morte celular desencadeada pelo Aβ. Provou-se que o aumento dos níveis de GRP78 e da atividade da caspase-4 observados em consequência do tratamento com o Aβ1−40 é mais pronunciado em cíbridos de Alzheimer do que em cíbridos preparados a partir de plaquetas de indivíduos saudáveis. Além disso, o decréscimo da sobrevivência celular e também o aumento na atividade da caspase-3, dos níveis da forma clivada da poli-ADP-ribose-polimerase (PARP), assim como no número de células apoptóticas observados em cíbridos de Alzheimer foi mais proeminente do que em cíbridos controlo tratados com o Aβ1−40. A morte celular por apoptose induzida pelo Aβ1−40 em ambas as linhas celulares mostrou envolver a libertação de Ca2+ do RE visto que a ativação da caspase-3 efetora de apoptose foi prevenida por dantroleno, um antagonista dos canais de Ca2+ associados aos reeptores de rianodina do RE. A interação mitocôndria/RE durante a morte celular induzida pelo Aβ foi ainda avaliada usando um modelo neuronal (capítulo 6). Em culturas primárias de neurónios corticais de rato, determinou-sede que modo o dano na atividade da COX afecta a perda da homeostasia de Ca2+ no RE e no citosol e promove a ativação da via de morte celular por apoptose mediada pela mitocôndria. Em neurónios corticais tratados com concentrações tóxicas de Aβ1-40, na presença de cianeto de potássio (KCN), um inibidor da COX, verificou-se uma acentuada libertação de Ca2+ do RE acompanhada pelo aumento dos seus níveis citosólicos, decréscimo da viabilidade celular e ainda ativação das caspases -9 e -3. No capítulo 7, investigámos a possibilidade dos AβO desencadearem “stress” do RE e disfunção neuronal através de um mecanismo dependente dos NMDARs, analisando a contribuição das subunidades NR2A e NR2B deste recetor glutamatérgicos. Em culturas primárias de hipocampo de rato tratadas com AβO mostrámos que a produção de superóxido mediada pela NADPH oxidase ocorre após a interação AβO-NR2B desregulando a homeostasia de Ca2+. Estes eventos precederam alterações na viabilidade celular e na ativação da via apoptótica mediada pelo “stress” do RE como é demonstrado pelo aumento dos níveis de GRP78, XBP-1 e GADD153/CHOP. O papel da subunidade NR2B no “stress” do RE, induzido por AβO, e na disfunção neuronal no hipocampo foi demonstrado usando ifenprodil, um antagonista desta subunidade dos NMDARs. Por outro lado, um antagonista das subunidades NR2A, apenas atenuou ligeiramente a neurotoxicidade induzida por AβO, negligenciando o envolvimento desta subunidade. Finalmente, estudámos o papel do “stress” do RE in vivo usando um modelo animal da doença de Alzheimer, osratinhos triplo transgénicos (3xTg-AD) (capítulo 8). Em comparação com a estirpe não-transgénica (non-Tg), observaram-se alterações nos marcadores de “stress” do RE em ratinhos 3xTg- AD que foram mais pronunciadas ao nível do hipocampo do que no córtex cerebral tanto em fêmeas como em machos, sendo as fêmeas aparentemente mais suscetíveis ao “stress” do RE. Além disso, os resultados obtidos neste modelo animal mostram que os níveis de marcadores de “stress” do RE estão alterados em animais jovens sugerindo o seu envolvimento nas fases precoces da patologia. Estes resultados foram corroborados por dados obtidos num modelo periférico da doença de Alzheimer. Em colaboração com a Prof. Isabel Santana dos Hospitais da Universidade de Coimbra e com o grupo ‘Sinalização e disfunção mitocondrial na neurodegenerescência’ do Centro de Neurociências e Biologia Celular (CNC), foi-nos possível utilizar células mononucleadas de sangue periférico humano (PBMCs), nomeadamente linfócitos, isolados de doentes em diferentes fases da doença de Alzheimer (ligeira, moderada e severa) e indivíduos com defeito cognitivo ligeiro (DCL) versus indivíduos não dementes (capítulo 8). Neste modelo periférico, pretendeu-se relacionar a disfunção cognitiva durante as diferentes fases da doença com marcadores de dano celular. Com este propósito investigámos as alterações nos níveis de Ca2+ do RE e no citosol e analisámos diferenças na expressão de marcadores do “stress” do RE e de proteínas apoptóticas associadas ao RE. Um decréscimo no conteúdo de Ca2+ deste organelo intracelular, acompanhado por aumento dos seus níveis no citoplasma, foi observado em PBMCs de indivíduos com DCL e doentes na fase ligeira que apresentaram também aumento nos marcadores do “stress” do RE, nomeadamente de GRP78 e XBP-1. Em PBMCs de doentesna fase moderadasevera, os níveis destas proteínas assemelharam-se aos obtidos em controlos. Contudo, nesta fase a via apoptótica mediada pelo “stress” do RE está já activada, como demonstrado pelo aumento dos níveis de GADD153/CHOP. Os resultados obtidos recorrendo a modelos humanos e não humanos de diferente complexidade, mostram que a morte celular apoptótica induzida pelo Aβ envolve a cooperação entre o RE e a mitocôndria, e que é desencadeado pela interação da Aβ com recetores glutamatérgicos NMDA, contribuindo assim para uma melhor compreensão dos mecanismos associados à patogénese desta doença.

Alzheimer’s disease (AD) is the most prevalent neurodegenerative disorder in the elderly that currently affects almost 35 million people worldwide. It is a chronic and progressive neurodegenerative illness characterized by memory deficits and cognitive decline due to synaptic and neuronal loss in the hippocampus and cerebral cortex. Considerable progress has been made in recent years towards better understanding the pathogenesis of AD but this knowledge has not yet been successfully translated into new and effective disease-modifying drugs. Only two classes of medication are currently available for the symptomatic treatment of AD but these drugs have only modest clinical benefits in terms of improved cognition and ultimately do not prevent disease progression. The abnormal deposition of amyloid-beta (Aβ) peptide in the brain of AD patients has suggested that it plays an essential role in AD pathogenesis. Although fibrillar species have long been considered to account for the neurotoxic effects of Aβ, it was recently demonstrated that soluble Aβ oligomers (AβO) are the main species responsible for synaptic and neuronal changes in AD. Accordingly to these findings, the previously proposed “amyloid cascade hypothesis” has been reformulated and it now considers that AβO are responsible for the brain alterations occurring during the early stages of the disease, leading to dementia. Therefore, preventing the formation or toxicity of these AβO may be the ultimate key to halting the progression of AD. This study was aimed to better understand the molecular mechanisms underlying the deleterious effects triggered by Aβ, focusing on its role in the induction of endoplasmic reticulum (ER) stress. Specifically, it was investigated: i) the ER/mitochondria cross-talk during Aβ-induced cell death and ii) the role of the glutamatergic N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR), in particular of its NR2A and NR2B subunits, as an upstream mechanism leading to Aβ-induced ER stress. In the first part of this work (chapter 4), we used mitochondrial DNA (mtDNA)-depleted ρ0 cells, characterized by the absence of functional mitochondria to demonstrate that ER stress-mediated apoptotic cell death induced by Aβ occurs through a mitochondria-dependent mechanism. We showed that the Aβ1−40 isoform of Aβ increases the levels of the chaperone GRP78 and activates caspase-4, two ER stress markers, and also depletes ER Ca2+ stores in both ρ0 cells and parental ρ+ cells. However, we found that only in Aβ1−40-treated ρ+ cells occur an increase in the levels of GADD153/CHOP, a pro-apoptotic transcription factor activated under ER stress conditions, activation of caspase-9 and -3 and increase in the number of TUNEL-positive apoptotic cells. In order to further investigate the mitochondria/ER interplay in AD pathogenesis, we used cybrid cells that recreate the defect in mitochondrial cytochrome c oxidase (COX) activity detected in platelets of sporadic AD patients (chapter 5). We showed that mitochondrial dysfunction arising from COX inhibition affects the ER stress response and subsequent cell death triggered by Aβ. Indeed, the increase in GRP78 levels and caspase-4-like activity observed upon Aβ1−40 treatment was more pronounced in AD cybrids than in cybrids prepared from platelets of non-demented controls. Furthermore, the decrease in cell survival as well as the increase in caspase-3-like activity, levels of cleaved poli-ADP-ribose-polymerase (PARP), a caspase-3 substrate, and TUNEL-positive apoptotic cells observed in Aβ1−40-treated AD cybrids was more prominent than in control cybrids. Apoptotic cell death induced by Aβ in both cell lines was shown to involve ER Ca2+ release since activation of the apoptosis effector caspase-3 was prevented by dantrolene, an inhibithor of Ca2+ channels associated with ER ryanodine receptors. The mitochondria/ER cross-talk during Aβ-induced cell death was further evaluated using a neuronal model (chapter 6). In primary cultures of rat brain cortical neurons it was analyzed how the impairment of COX activity affects the loss of ER and cytosolic Ca2+ homeostasis and promotes the activation of the mitochondria-mediated apoptotic cell death pathway. In cortical neurons treated with toxic concentrations of Aβ1-40 in the presence of potassium cyanide (KCN), a COX inhibitor, it was observed that the increase in ER Ca2+ release and subsequent rise of cytosolic Ca2+ levels, the decrease in cell survival and activation of apoptosis-related caspase-9 and -3 were potentiated in comparison with neurons treated with Aβ1-40 in the absence of KCN. In chapter 7, we investigated whether Aβ oligomers (AβO) trigger ER stress by an NMDAR-dependent mechanism leading to neuronal dysfunction and analyzed the contribution of NR2A and NR2B subunits of this glutamate receptor. In primary cultures of rat brain hippocampal neurons treated with AβO we showed that NADPH oxidase-mediated superoxide production occurs downstream of AβO-NR2B interaction and impairs Ca2+ homeostasis. These events precede changes in cell viability and activation of the ER stressmediated apoptotic pathway as demonstrated by the increase in levels of GRP78, XBP-1 and GADD153/CHOP. The role of NR2B subunit, but not of NR2A, on AβO-induced ER stress and hippocampal neuronal dysfunction was demonstrated using ifenprodil, an antagonist of NR2B subunits and NVP AAM077, an NR2A antagonist that only slightly attenuated AβO-induced neurotoxicity. Finally, we studied the role of ER stress in vivo using an AD animal model, the triple transgenic mice (3xTg-AD) (chapter 8). In comparison with nontransgenic (non-Tg) mice, there were alterations in ER stress markers in 3xTg- AD mice that were more pronounced in the hippocampus than in the cerebral cortex both in male and female mice, and females were shown to be more susceptible to ER stress. Furthermore, data obtained in this animal model show that the levels of ER stress markers are changed in young mice suggesting its role in early disease stages. These results were corroborated by studies in a peripheral model of AD. In collaboration with Prof. Isabel Santana from the “Hospitais da Universidade de Coimbra” and the group “Mitochondrial dysfunction and signalling in neurodegeneration” from the Center for Neuroscience and Cell Biology (CNC) we were able to use human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), namely lymphocytes, isolated from patients in different stages of the disease (mild, moderate and severe) and individuals with mild cognitive impairment (MCI) versus non-demented age-matched subjects (chapter 8). This peripheral model was used in order to identify the relationship between cognitive impairment occurring during the progression of the disease and markers of cell injury. A decrease in ER Ca2+ levels, followed by an increase in its cytosolic levels, was observed in PBMCs from individuals with MCI and mild AD patients that also presented increased levels of ER stress markers, namely GRP78 and XBP-1. In PBMCs from moderate-severe AD patients, the levels of these ER stress markers were similar to that measured in controls. However, on the early stages the ER stress-mediated apoptotic pathway was already triggered, as demonstrated by an increase in GADD153/CHOP levels. The results obtained using human and non-human models with different complexity, show that apoptotic cell death induced by Aβ involves the cooperation between ER and mitochondria and that it is triggered by the interaction of Aβ with the NMDA subtype of glutamatergic receptors for glutamate, thus increasing our knowledge about the mechanisms implicated in AD pathogenesis.