Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/18220
Title: Somatic embryogenesis in Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt (tamarillo) : optimization and molecular analysis
Authors: Correia, Sandra Isabel Marques 
Orientador: Canhoto, Jorge Manuel Pataca Leal
Keywords: Embriogénese somática -- cyphomandra betacea
Issue Date: 2011
Citation: CORREIA, Sandra Isabel Marques - Somatic embryogenesis in Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt (tamarillo) : optimization and molecular analysis. Coimbra : [s.n.], 2011
Abstract: Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt (tamarillo) is a small solanaceous tree which produces edible high nutritional fruits. Several lines of research have shown the interest of this species to understand particular aspects of in vitro morphogenesis, in particular somatic embryogenesis (SE). SE is an important biotechnological tool with great potential for rapid large-scale clone propagation. In addition, genetic transformation and cryopreservation procedures in many plant species rely on efficient SE protocols. One of the pathways to induce SE in tamarillo is a two-step process in which embryogenic tissues and non-embryogenic callus are first produced (induction phase) in an auxin-rich medium and then developed into embryos, following the transfer to an auxin-free medium (development phase). Explants as zygotic embryos, hypocotyls and leaves can participate in this type of somatic embryo formation. To uncover some of the limiting steps of SE induction and to identify markers directly related to this process, which would allow achieving more efficient results, not only with tamarillo but also with other woody species, three strategies were followed: the improvement of induction and somatic embryo development protocols, the investigation of a SE inhibitory protein, previously identified, and a comparison between proteomic profiles of embryogenic and non-embryogenic calli. Previous works have shown that SE in tamarillo can be easily induced from juvenile plant material. In this work we were able to clone an adult tamarillo tree through SE. To overcome the lack of potential of adult tissues for SE, an indirect approach was attempted, in which shoots from an adult tree were first established in vitro and then wounded leaves were used for SE induction. These results open the way for large-scale cloning of elite tamarillo trees through SE. The optimization of the somatic embryo development protocol was also achieved by increasing the number of somatic embryos that can be converted into plantlets. The manipulation of sucrose concentration showed that 0.11M sucrose and dark conditions before conversion increase the number of morphologically normal somatic embryos produced, a critical step to enhance the yield of converted embryos. The comparison between mature zygotic embryos and normal somatic embryos, after the maturation period, reflects an inefficient accumulation of storage compounds in tamarillo somatic embryos, namely in what concerns lipids storage. Poor storage accumulation may be responsible for the abnormal development displayed by most of these embryos. In tamarillo, embryogenic and non-embryogenic cells arise side by side from the same cultured explants, a condition ideal to evaluate molecular and biochemical changes occurring in the different types of calli. Moreover, different types of explants and auxins led to the same morphological responses, indicating that different tissues can perceive the same stimulus in a similar way, pointing out to a general behavior of the cells under certain stimulus, which can be extended to understand embryogenesis in a more integrated perspective. Previous comparative proteomic analyses identified a protein (NEP25, 26.5 kDa) consistently present in non-embryogenic calli. In this work, we evaluated the role of NEP25 on somatic embryogenesis induction, following two experimental strategies: 1) SE induction on knock-out lines of Arabidopsis thaliana and 2) post-transcriptional NEP25 gene down-regulation in tamarillo. Tamarillo NEP25 gene down-regulation was achieved by an improved Agrobacterium-mediated transformation protocol that allowed obtaining more than 80 self-rooted kanamycin resistant plants from a single embryogenic cell line. The data obtained associate (for the first time) a putative member of the SpoU methylase super family with the inhibition of SE. This is a protein family that promotes tRNA/rRNA stabilization through its methylation. The absence of particular phenotypes resulting from gene silencing in Arabidopsis thaliana or from NEP25 down-regulation in tamarillo suggests that other proteins of this family may have a redundant role during the SE induction process. Trying to find embryogenic-specific proteins, a comparative analysis of the proteome of tamarillo’s embryogenic and non-embryogenic calli was performed. Through two-dimensional electrophoresis (2-DE) and LC-MS/MS, proteins exclusively or predominantly expressed in embryogenic tissues were identified, such as enolases, adenylate kinases, fumarate hydratases, treonine synthases (metabolic proteins). On the other hand, pathogenesis-related proteins and fructokinases (stress and defense related proteins) occur mainly in non-embryogenic callus. An interesting differential expression of heat-shock proteins in embryogenic cells was also detected. The data so far obtained indicate that, for the same type of calli (embryogenic tissue or non-embryogenic callus), a strong resemblance occurs between protein profiles, in spite of the auxin (2,4-D or picloram) or explant (young leaves or zygotic embryos) tested. The information gathered with this work may help to answer to some of the limiting steps of SE in tamarillo, to which fundamental knowledge from the classical model plants has been insufficient. Finding proteins directly involved in the acquisition of embryogenic competence may help to understand the regulatory mechanisms of this process.
Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt (tamarillo) é uma pequena árvore da família Solanaceae que produz frutos comestíveis bastante nutritivos. Várias linhas de investigação têm demonstrado o interesse desta espécie para a compreensão de aspectos específicos da morfogénese in vitro, em particular da embriogénese somática (ES). A ES é uma ferramenta biotecnológica importante com um enorme potencial para a rápida propagação clonal em grande escala. Além disso, os procedimentos de transformação genética e criopreservação em muitas espécies vegetais baseiam-se em protocolos eficazes de ES. Uma das muitas formas de induzir ES no tamarilho consiste num processo em duas fases no qual os tecidos embriogénicos e os calos não embriogénicos são inicialmente produzidos (fase de indução) num meio rico em auxina e, após a sua transferência para um meio isento de auxina, formam embriões (fase de desenvolvimento). Vários tipos de explantes, como embriões zigóticos, hipocótilos e folhas têm capacidade para sofrer embriogénese somática. De modo a ultrapassar alguns dos passos restritivos da indução de ES e identificar marcadores directamente relacionados com este processo, que permitiriam obter resultados mais eficazes, não só no tamarilho mas também com outras espécies lenhosas, foram seguidas três estratégias: a melhoria dos protocolos de indução e desenvolvimento de embriões somáticos, a investigação de uma proteína inibidora de ES, previamente identificada, e a comparação dos perfis proteicos de calos embriogénicos e não embriogénicos. Trabalhos anteriores têm demonstrado que a indução de ES no tamarilho pode ser facilmente obtida a partir de material vegetal juvenil. Com este trabalho, foi-nos possível clonar uma árvore de tamarilho adulta por ES. Para superar o reduzido potencial de ES nos tecidos adultos, foi experimentada uma abordagem indirecta, na qual os rebentos de uma árvore adulta foram, primeiramente, estabelecidos in vitro e, depois, as folhas foram utilizadas na indução de ES. Estes resultados abrem o caminho para uma clonagem em larga escala de árvores seleccionadas de tamarilho por ES. A optimização do protocolo de desenvolvimento de embriões somáticos também foi alcançada aumentando o número de embriões somáticos que podem ser convertidos em plântulas. A manipulação da concentração de sacarose para 0,11M e a realização das culturas no escuro, antes da conversão, aumentam o número de embriões somáticos morfologicamente normais produzidos, um passo essencial para aumentar a produção de embriões convertidos. A comparação entre embriões zigóticos maduros e embriões somáticos normais, após o período de maturação, reflecte uma acumulação ineficaz de compostos de armazenamento nos embriões somáticos de tamarilho, nomeadamente em relação ao armazenamento de lípidos. A fraca acumulação de reservas poderá ser responsável pelo desenvolvimento anormal registado na maioria destes embriões. No tamarilho, as células embriogénicas e não embriogénicas surgem lado a lado nos mesmos explantes, uma condição ideal para avaliar as alterações moleculares e bioquímicas observadas nos diferentes tipos de calos. Além disso, os diferentes tipos de explantes e auxinas causam as mesmas respostas morfológicas, o que indica que diferentes tecidos podem responder ao mesmo estímulo de forma semelhante, apontando para um comportamento geral das células sob a acção de determinados sinais que podem ser utilizados para compreender a embriogénese numa perspectiva mais integradora. Análises proteómicas comparativas anteriores identificaram uma proteína (NEP25, 26.5 kDa) presente, de forma consistente, em calos não embriogénicos. Neste trabalho, avaliámos a função da NEP25 na indução de embriogénese somática, seguindo duas estratégias experimentais: 1) indução de ES em linhas knock-out de Arabidopsis thaliana e 2) down-regulation pós-transcripcional do gene NEP25 no tamarilho. A down-regulation do gene NEP25 em tamarilho foi conseguida através de um protocolo optimizado de transformação via Agrobacterium que permitiu obter mais de 80 plantas resistentes à canamicina a partir de uma única linha celular embriogénica. Os dados obtidos associam (pela primeira vez) um membro putativo de uma super-família de metilases de RNA (SpoU) à inibição de ES. Esta é uma família de proteínas que promove a estabilização de tRNA/rRNA através da sua metilação. A ausência de fenótipos específicos resultantes do silenciamento de genes em Arabidopsis thaliana ou da down-regulation de NEP25 no tamarilho sugere que outras proteínas desta família poderão ter um papel redundante no processo de indução de ES. Na tentativa de encontrar proteínas específicas de embriogénese somática, foi realizada uma análise comparativa dos perfis proteicos de calos embriogénicos e não embriogénicos de tamarilho. Através de electroforese bidimensional (2-DE) e LCMS/ MS, foram identificadas proteínas expressas, exclusiva ou predominantemente, em tecidos embriogénicos, como, por exemplo, enolase, adenilato-cinase, fumaratohidratase, treonina-sintase (proteínas metabólicas). Por outro lado, as proteínas associadas à patogénese, como a frutocinase (proteínas de stress e defesa), ocorrem principalmente em calos não embriogénicos. Também foi detectada uma interessante expressão diferencial de proteínas de choque térmico nas células embriogénicas. Os dados até agora obtidos indicam que, no mesmo tipo de calos (tecido embriogénico ou calo não embriogénico) verifica-se uma grande semelhança entre os perfis proteicos, independentemente da auxina (2,4-D ou picloram) ou explante (folhas jovens ou embriões zigóticos) testados. A informação recolhida com este trabalho poderá ajudar a responder a alguns dos passos restritivos da ES no tamarilho, para a qual os conhecimentos fundamentais sobre as plantas modelo tradicionais têm sido insuficientes. Encontrar as proteínas directamente envolvidas na aquisição de competência embriogénica poderá ajudar a compreender os mecanismos reguladores deste processo.
Description: Tese de doutoramento em Biologia (Fisiologia) apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/18220
Rights: openAccess
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