VGLUT1 and VGLUT2 cleavage under excitotoxic conditions and in cerebral ischemia

Abstract

Os acidentes vasculares cerebrais (AVC) constituem uma doença complexa, causada sobretudo pelo bloqueio de uma artéria responsável pela irrigação do cérebro (isquémia), provocando graves danos neurológicos. Os AVC são uma das principais causas de morte e de incapacidade ou invalidez a longo prazo na população adulta em países desenvolvidos, incluindo Portugal. Os AVC isquémicos iniciam-se com a oclusão de vasos sanguíneos cerebrais, frequentemente as artérias cerebral média ou anterior, e desencadeiam uma cascata de eventos nomeadamente uma falha na bionergética, excitotoxicidade, stress oxidativo, despolarização da membrana plasmática, e inflamação, que causam morte celular. A excitotoxicidade é um dos eventos iniciais após um AVC isquémico, e consiste na estimulação excessiva de receptores de glutamato devido a uma acumulação excessiva de glutamato no espaço extracelular. Os mecanismos excitotóxicos podem provocar morte celular de forma aguda (necrose) ou iniciar eventos moleculares que levam a morte celular apoptótica retardada. A excitotoxicidade desempenha também um papel importante noutras doenças neurológicas, como a epilepsia e doenças neurodegenerativas, e é considerada um dos principais alvos terapêuticos para tratar AVC. A investigação sobre a isquémia cerebral tem-se focado sobretudo nos efeitos pós-sinápticos ao nível das sinapses glutamatérgicas. Considerando que a libertação de glutamato por exocitose depende da acumulação deste neurotransmissor em vesículas sinápticas mediada por transportadores vesiculares de glutamato (VGLUTs), e que alterações nos níveis de VGLUTs afectam directamente a libertação de glutamato, neste trabalho investigaram-se possíveis variações nos níveis de VGLUTs após insultos excitotóxicos ou isquémicos. Os resultados obtidos mostram a clivagem do VGLUT2 por calpaínas em neurónios de hipocampo em cultura após estímulo excitotóxico com glutamato, e após privação de oxigénio e glucose. A clivagem do VGLUT2 foi também observada após injecção de cainato no hipocampo, e depois de oclusão transitória da artéria cerebral média (MCAO) em murganhos. Por outro lado, o VGLUT1 só foi clivado após estímulo excitotóxico de glutamato, ainda que esse efeito tenha sido menos significativo que o observado para o VGLUT2. Além disso, verificou-se um aumento dos níveis de VGLUT1 após injecção de cainato no hipocampo de murganhos. A incubação de vesículas sinápticas isoladas do córtex cerebral de ratos e de uma proteína de fusão de GST com o C-terminal do VGLUT2 com calpaína recombinante também causou a clivagem do VGLUT2. Na clivagem de GST-VGLUT2 C-terminal observou-se a formação de produtos de clivagem. Ensaios de immublotting usando anticorpos específicos contra diferentes regiões do VGLUT2, assim como a sequenciação do terminal amínico das formas truncadas da proteína de fusão GST-VGLUT2, permitiram identificar dois locais de clivagem pela calpaína no VGLUT2, nos aminoácidos Asn534 e Lys542. A utilização de um péptido designado TAT-VGLUT2, contendo a sequência de aminácidos da região do terminal carboxílico do VGLUT2, reduziu especificamente a clivagem do VGLUT2 em neurónios de hipocampo sujeitos a estimulação excitotóxica de glutamato, sem afectar a capacidade da calpaína na clivagem de outros substratos. O C-terminal do VGLUT2 também possui uma sequência de consenso (DELD) para clivagem pela caspase-3, mas o transportador não foi clivado por esta protease em neurónios de hipocampo sujeitos a estimulação excitotóxica de glutamato, nem em neurónios sujeitos a indução de apoptose com estaurosporina ou remoção dos factores tróficos. No entanto, foi observada a clivagem e formação de um produto de clivagem quando a proteína de fusão GST-VGLUT2 C-terminal foi incubada com caspase-3 recombinante, e a formação deste produto não ocorreu após mutação dos resíduos de asparatato para alanina na sequência de consenso. Experiências de imunocitoquímica usando neurónios de hipocampo transfectados com proteínas de fusão da GFP com VGLUT2, ou com as formas truncadas do transportador nos aminoácidos 534 e 542, mostraram que a clivagem do VGLUT2 por calpaína reduz a sua localização sináptica. Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que o VGLUT2, ao contrário do VGLUT1, é clivado por calpaínas em condições excitotóxicas ou isquémicas, alterando a sua localização intracelular. Esta alteração na distribuição do VGLUT2 pode afectar a transmissão sináptica glutamatérgica e contribuir para uma redução da morte celular em situações de isquémia ou excitotoxicidade. O facto de o VGLUT2 ser sobretudo expresso nas fases iniciais do desenvolvimento permite sugerir que a sua clivagem por calpaína pode ter um papel importante em acidentes vasculares cerebrais no recém-nascido.

Stroke is a complex disease mainly caused by a blockage of an artery responsible for blood supply to the brain (ischemia), causing severe neurological impairment. It constitutes a leading cause of death and long term adult disability in the developed countries, including Portugal. The blood vessel occlusion in the ischemic brain injury, commonly the middle and anterior cerebral arteries, is followed by a cascade of events namely bionergectic failure, excitotoxicity, oxidative stress, peri-infarct depolarizations, and inflammation, ultimately leading to cell death. Excitotoxicity is one of the first events in the ischemic stroke, and consists in the overstimulation of glutamate receptors caused by an extracellular accumulation of glutamate. Excitotoxic mechanisms can cause acute cell death (necrosis) or initiate events that ultimately lead to delayed apoptotic-like cell death. Excitotoxicity is also involved in other neurological disorders, such as epilepsy and neurodegenerative diseases, and it is indeed considered an important target for stroke therapy. So far, research in cerebral ischemia has been focusing on the postsynaptic effects in glutamatergic synapses. However, considering that the exocytotic release of glutamate depends on the uptake of the neurotransmitter into synaptic vesicles mediated by vesicular glutamate transporters (VGLUTs), and that changes in VGLUTs levels will directly affect the vesicle loading with glutamate and neurotransmitter release, we investigated putative changes in VGLUT levels after excitotoxic or ischemic insults. We found that VGLUT2 was cleaved by calpains following glutamate excitotoxic stimulation or oxygen and glucose deprivation in cultured hippocampal neurons. VGLUT2 cleavage was also observed after intrahippocampal injection of kainate and following transient middle cerebral artery occlusion (MCAO) in mice. In contrast, VGLUT1 was only cleaved after stimulation of hippocampal neurons with glutamate, but to a lower extent than VGLUT2, and was upregulated after intrahippocampal injection of kainate. Incubation of isolated cerebrocortical synaptic vesicles with recombinant calpain also lead to a downregulation of VGLUT2, and a fusion protein of GST with VGLUT2 C-terminal region was cleaved upon incubation in vitro with recombinant calpain. Immunoblot analysis using antibodies that target different regions of VGLUT2, and N-terminal sequencing of the cleavage products resulting from incubation of recombinant calpain with the GST-VGLUT2 C-terminal fusion protein, showed that calpain cleaves VGLUT2 at amino acids Asn534 and Lys542. Accordingly, incubation of cultured hippocampal neurons with a TAT-VGLUT2 peptide, containing the C-terminal region of VGLUT2, inhibited the downregulation of the hippocampal neurons subjected to excitotoxic conditions, without affecting calpain activity towards other substrates. Although VGLUT2 contains a consensus DELD sequence that is typically targeted by caspase-3, the transporter was not cleaved by this protease in hippocampal neurons following glutamate stimulation, or after induction of apoptosis with staurosporine or by trophic factor withdrawal. However, incubation of the GST-VGLUT2 C-terminal fusion protein with recombinant caspase-3 was able to produce a cleavage product, that was not found upon mutation of the aspartic acid residues in the consensus sequence to alanine residues. Immunocytochemistry of hippocampal neurons expressing GFP fusion proteins with the full length VGLUT2, or VGLUT2 truncated at Asn534 or at Lys 542, showed that the truncated forms that result from calpain cleavage of VGLUT2 have reduced the transporter synaptic localization. Taken together our results show that VGLUT2, unlike VGLUT1, is cleaved by calpain under excitotoxic or ischemic conditions, which is likely to affect glutamatergic neurotransmission and may contribute to a reduced cell death during excitotoxic and ischemic events. The fact that VGLUT2 is mainly expressed early in development suggests that calpain cleavage may have a role in neonatal brain injury.