Purificação e Caracterização de uma Alfa - Amilase Produzida por Thermus Filiformis OrK A2

Abstract

A bactéria termofílica Thermus filiformis Ork A2 produz uma alfa -amilase extracelular. Esta amilase foi purificada a partir do sobrenadante da cultura por duas cromatografias de troca iónica, S-Sepharose seguida de Mono Q, com um rendimento final de 55% e com um factor de purificação de 24x. A massa molecular foi estimada em 60000 Da por SDS-PAGE. A enzima apresenta conteúdo elevado em aminoácidos básicos e não-polares, e o seguinte terminal amínico: Thr-Ala-Asp-Leu-Ile-Val-Lys-Ile-Asn-Phe. A enzima possui actividade óptima em amido solúvel a pH 5,5-6,0 e 95oC, e é estável na gama de pH de 4,0-8,0. O ião cálcio aumenta a estabilidade da enzima a temperaturas superiores a 80oC, aumentando os tempos de meia-vida de actividade para mais de 8 h a 85oC, 80 min a 90oC e 19 min a 95oC. O agente quelante EDTA inibiu a actividade amilolítica, sendo esta inibição revertida na presença de cálcio ou estrôncio. A à -amilase foi também inibida por i›es mercúrio e cobre, e ácido paracloromercuribenzóico, sendo esta última inibição revertida na presença de ditiotreitol. Os agentes redutores ditiotreitol e á -mercaptoetanol activaram a enzima. A enzima apresentou uma cinética de Michaelis-Menten para o amido com Km de 5,0 mgáml-1 e kcat/Km de 5,2 mlámg-1s-1. Valores semelhantes foram obidos para a hidrólise de amilose, amilopectina e glicogénio. O perfil de hidrólise foi semelhante para maltooligossacarídeos e polissacarídeos, com maltose como produto maioritário de hidrólise. Glicose e maltotriose foram produzidos como produtos secundários, contudo a glicose foi produzida em níveis elevados apenas após seis horas de digestão. Este é a primeira caracterização de uma à -amilase produzida por uma estirpe do género Thermus.