The role of mitochondrial dynamics in autophagy = A função da dinâmica mitocondrial durante a autofagia

Abstract

As mitocôndrias são organelos essenciais para a vida e morte das células. A maioria do ATP celular é produzido nas mitocôndrias e estes organelos são fundamentais para a regulação de vários processos celulares, como vias de sinalização mediadas por Ca2+ e apoptose (Ernster and Schatz, 1981; Green and Kroemer, 2004; Rizzuto et al., 2000). A versatilidade funcional deste organelo é acompanhada pela sua complexidade morfológica (Bereiter-Hahn and Voth, 1994). Durante a vida celular, as mitocôndrias sofrem continuamente processos de fusão e fragmentação. Estas alterações morfológicas são reguladas por uma família de proteínas que controla a forma do organelo. Nos mamíferos, a fusão mitocondrial é controlada pelas MFN1 e MFN2 na membrana externa da mitocôndria e OPA1 na membrana interna. A fragmentação mitocondrial é regulada pela proteína citoplasmática DRP1, que se desloca para a membrana externa da mitocôndria, onde participa na reacção de fragmentação, e pela proteína FIS1, que funciona presumivelmente como o adaptador de DRP1 na membrana mitocondrial externa (Wasilewski and Scorrano, 2009). Um nível adicional de complexidade deste organelo consiste na ultra-estrutura da membrana interna. A membrana interna pode ser subdividida numa membrana que a delimita e em cristas, que representam compartimentos separados, ligados à membrana por junções tubulares estreitas (Frey and Mannella, 2000). Durante a progressão da apoptose, observa-se uma dramática reestruturação das cristas mitocondriais (Scorrano et al., 2002) e a fragmentação do organelo (Frank et al., 2001). Alterações na forma das mitocôndrias regulam um número crescente de processos celulares, como a sinalização mediada por Ca2+ (Szabadkai et al., 2004), a formação de dendrites (Li et al., 2004), a migração de linfócitos (Campello et al., 2006), o ciclo celular (Mitra et al., 2009) e a expectativa de vida de fungos (Scheckhuber et al., 2007). No entanto, o nosso conhecimento sobre as funções que este organelo desempenha e a sua morfologia durante a autofagia é escasso. O objectivo desta tese consistia em explorar a relação entre dinâmica mitocondrial e autofagia. Na primeira parte desta tese, estudámos se a mitofagia pode ser desencadeada unicamente pela fragmentação mitocondrial ou se a disfunção do organelo, muitas vezes associada à fragmentação, é um pré-requisito para a sua degradação. Para tal, analisámos o efeito da sobre-expressão de FIS1 na indução de autofagia. FIS1 é uma proteína com duas funções, que regula independentemente a fragmentação mitocondrial e a apoptose, através de um efeito directo no funcionamento do organelo (Alirol et al., 2006). Formas mutadas desta proteína, que discriminam especificamente a fragmentação da disfunção mitocondrial, permitiram-nos analisar se a mitofagia ou um processo mais generalizado de autofagia são induzidos por fragmentação e/ ou disfunção mitocondrial. A sobre-expressão de FIS1 ou FIS1 1, que promove disfunção mitocondrial mas não leva à fragmentação do organelo, induziu autofagia. Pelo contrário, a sobre-expressão de FIS1K148R, que causa fragmentação mitocondrial sem levar à disfunção do organelo, não induziu autofagia nas células. Em células que sobre-exprimiam FIS1 foram observadas mitocôndrias fragmentadas e disfuncionais circundadas por autofagosomas, sugerindo que, pelo menos algumas destas mitocôndrias, são degradadas por autofagia. É possível, portanto, concluir que é a disfunção mitocondrial, e não a fragmentação do organelo, que conduz à indução de autofagia (Gomes and Scorrano, 2008). Na segunda parte desta tese, pretendíamos perceber se a morfologia mitocondrial é alterada durante a indução de autofagia e se a forma como as células respondem à autofagia é influenciada por alterações na morfologia mitocondrial. Surpreendentemente, a indução de autofagia por restrição nutritiva induziu o alongamento das mitocôndrias in vitro e in vivo. O alongamento mitocondrial é um evento essencial que determina o destino das células durante a autofagia. Nas células onde a autofagia é induzida, os níveis de cAMP aumentam rapidamente e levam à activação da PKA, que fosforila a proteína de fragmentação DRP1. Desta forma, DRP1 mantém-se no citoplasma, o que resulta no alongamento mitocondrial, por ausência de oposição à fusão do organelo. As mitocôndrias alongadas estão protegidas da degradação por autofagia, apresentam maior número de cristas onde a ATPase oligomeriza para manter a produção de ATP e permitir a sobrevivência celular. Pelo contrário, se o alongamento é bloqueado, as mitocôndrias tornam-se disfuncionais e “canibalizam” o ATP do citoplasma para manter o potencial de membrana, levando à morte celular (Gomes et al, in press). Em conclusão, a autofagia é mais um processo celular regulado por alterações de morfologia e actividade mitocondrial.

Mitochondria are key organelles for life and death of the cell. They provide most of the cellular ATP and play crucial functions in different cellular processes, ranging from Ca2+ signalling to apoptosis (Ernster and Schatz, 1981; Green and Kroemer, 2004; Rizzuto et al., 2000). Mitochondrial functional versatility is matched by their morphological diversity. During cell life, mitochondria continuously fuse and divide (Bereiter-Hahn and Voth, 1994). These events are regulated by a growing family of mitochondria-shaping proteins. In mammals, mitochondrial fusion is controlled by mitofusins (MFN) 1 and 2 in the outer mitochondrial membrane (OMM) and OPA1 in the inner mitochondrial membrane (IMM). Mitochondrial fission is regulated by DRP1, a cytosolic protein that has to translocate to the OMM to participate in the fission reaction and its presumable adaptor in the OMM, FIS1 (Wasilewski and Scorrano, 2009). Another level of complexity consists in the ultrastructure of the IMM. The IMM can be subdivided in an inner boundary membrane and in the cristae, that represent separate compartments, bound to the inner boundary by narrow tubular junctions (Frey and Mannella, 2000). Remodelling of mitochondrial cristae (Scorrano et al., 2002) and fragmentation of the organelle network (Frank et al., 2001) participate in the progression of apoptosis. Moreover, changes in mitochondrial shape regulate a growing number of other cellular processes, such as calcium signalling (Szabadkai et al., 2004), formation of dendritic spines (Li et al., 2004), migration of lymphocytes (Campello et al., 2006), cell cycle (Mitra et al., 2009) and even lifespan in lower eukaryotes (Scheckhuber et al., 2007). However, our understanding of the role of mitochondria and of their morphology during autophagy is scarce. The aim of this thesis was to explore the relationship between mitochondrial dynamics and autophagy. In the first part of this thesis, we addressed whether mitophagy could be triggered simply by mitochondrial fission or whether dysfunction, which is often associated with fragmentation of the organelle, was also required. In order to answer to these questions, we analyzed the effect of enforced FIS1 expression on autophagy. FIS1 is a bifunctional protein that independently regulates mitochondrial fission and apoptosis, through a direct effect on mitochondrial function (Alirol et al., 2006). The availability of mutants that could specifically dissociate mitochondrial fission or dysfunction allowed us to verify if mitophagy or a more generalized process of autophagy could be sustained by mitochondrial fission and/ or dysfunction . Enforced expression of FIS1 or of FIS1 1, that prompts mitochondrial dysfunction but not fission, induced autophagy. In contrast, overexpression of FIS1K148R that causes mitochondrial fragmentation but not dysfunction did not induce autophagy. Additionally, fragmented, dysfunctional mitochondria overexpressing FIS1 were found surrounded by autophagosomes, suggesting that at least some of these mitochondria are degraded by autophagy. Therefore, mitochondrial dysfunction rather than fragmentation triggers autophagy, suggesting that mitochondrial dysfunction can feedback to the autophagic machinery to activate it (Gomes and Scorrano, 2008). In the second part of this thesis we aimed at understanding whether mitochondrial morphology changes during induction of autophagy and if the final outcome of autophagy was influenced by changes in mitochondrial morphology. Surprisingly, we found that during starvation mitochondria elongate both in vitro and in vivo. Mitochondrial elongation is a crucial event that determines cell fate during autophagy. In starving cells, a rapid increase in cAMP levels activates PKA that in turn phosphorylates the pro-fission molecule DRP1, keeping it in the cytosol and allowing unopposed mitochondrial fusion. Elongated mitochondria are protected from autophagic elimination, display denser cristae where ATPase can oligomerize to maintain ATP production and to allow survival of starving cells. On the contrary, if elongation is blocked, mitochondria become dysfunctional and “cannibalize” cytoplasmic ATP to maintain their membrane potential, precipitating cell death (Gomes et al, in press). In summary, our findings exemplify a further cellular process, autophagy, that is regulated by changes in mitochondrial morphology and activity.