Desenvolvimento e optimização de uma metodologia analítica para a determinação de a-e B-amanitina em urina humana por LC-MS/MS

Abstract

A colheita de cogumelos silvestres é uma prática ainda muito presente nos dias de hoje, por todo o mundo. Apesar do consumo da maioria dos cogumelos silvestres existentes ser inofensiva para o ser humano, existem algumas espécies que possuem na sua constituição substâncias tóxicas, cuja penetração no organismo, via tracto digestivo, causa o desenvolvimento de efeitos nocivos em diferentes tecidos. O envenenamento por cogumelos Amanita é uma rara mas séria causa de intoxicação humana fatal. As amatoxinas, um grupo de octapeptídeos biciclícos produzidas pela espécie Amanita phalloides, são responsáveis pela elevada toxicidade destes fungos, sendo a α-amanitina e a β-amanitina as toxinas letais maioritárias. Estas causam necrose celular, especialmente no fígado e nos rins, conduzindo à morte por falência hepática e insuficiência renal aguda. O presente trabalho teve como objectivo o desenvolvimento, optimização e aplicação de uma metodologia analítica por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa sequencial (LC-MS/MS), após um pré-tratamento para precipitação de proteínas por solvente orgânico e procedimento de extracção em fase sólida (SPE), para a determinação das amatoxinas α- e β-amanitina, em amostras de urina humana. Os parâmetros de validação definidos para este método englobaram linearidade, limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ), selectividade, sensibilidade, repetibilidade e recuperação da extracção, de forma a garantir fiabilidade nos resultados analíticos obtidos. O método desenvolvido provou ser específico e selectivo, com valores de LD e LQ para a α-amanitina de 1.93 e 3.29 ng/mL e para a β-amanitina de 1.74 e 3.16 ng/mL, respectivamente. A lineariedade estudada em amostras fortificadas foi satisfatória (0.97 para a α-amanitina e 0.98 para a β-amanitina) num intervalo de 5 a 20 ng/mL. A repetibilidade foi verificada ao nível de 10 ng/mL (n=3) de α- amanitina e β-amanitina em amostras de urina fortificadas, com coeficientes de variação obtidos de 3.68 e 2.33%, respectivamente. A recuperação do método extractivo desenvolvido apresentou bons resultados para as baixas concentrações RESUMO xii analisadas, com percentagens entre os 64 e 70% para a α-amanitina, e entre os 64 e 68% para a β-amanitina. A metodologia descrita foi, posteriormente, aplicada a uma amostra real de urina de cadáver, disponibilizada pelo Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal (INML, I.P.). A análise da amostra forense em questão visou demonstrar a capacidade da metodologia desenvolvida para aplicação e implementação em casos reais de intoxicação por amatoxinas. A metodologia analítica desenvolvida tanto a nível de extracção, como de sistema cromatográfico, é inovadora, apresentando um elevado potencial na identificação e detecção de α- e β-amanitinas em amostras de urina. O método descrito poderá ser aplicável à determinação de α- e β-amanitinas a outras amostras biológicas, como fígado e rins. Palavras-chave: α-Amanitina; β-Amanitina; Intoxicação; SPE; LC-MS/MS