Condensins and mitotic chromosome structure: functional and dynamic analysis in Drosophila Melanogaster

Abstract

The condensed state of mitotic chromosomes is crucial for the faithful segregation of the genome during cell division. Chromosome condensation not only allows the physical compaction of chromatin but also promotes the resolution of topological problems such as intertwines between sister chromatids and different chromosomes. Key factors implicated in the formation of mitotic chromosomes are the condensin I and II complexes. However, the exact contribution of these complexes and the molecular mechanisms involved are far from being understood. The work reported in this thesis aims to further our understanding on the role of condensins in the structure of mitotic chromosome in Drosophila melanogaster. The first part of the thesis describes the phenotypic analysis of S2 cells in which the condensin I subunit Barren/CAP-H was depleted. The results showed that mitotic chromosomes are able to condense but fail to resolve sister chromatids. Additionally, Barren/CAP-H-depleted cells show chromosome congression defects that are not associated to abnormal kinetochoremicrotubule interaction. Instead, the centromeric and pericentromeric heterochromatin of Barren/CAP-H-depleted chromosomes shows severe structural abnormalities. The data suggests that centromeric heterochromatin organized in the absence of Barren/CAP-H cannot withstand the forces exerted by the mitotic spindle and undergoes irreversible distortion. The second part of the thesis reports the in vivo analysis of the dynamic behavior of condensin I during early embryonic divisions. We find that Barren-EGFP associates with chromatin early in prophase concomitantly with the initiation of chromosome condensation. Barren-EGFP loading starts at the centromeric region from where it spreads distally reaching maximum accumulation at metaphase/early anaphase. Furthermore, FRAP analysis indicates that most of the bound protein exchanges rapidly with the cytoplasmic pool during mitosis. In the third the role of condensin II specific subunits was addressed. The results, although preliminary, indicate that this complex does not seem to be involved in mitotic chromosome structure. Taken together, the results elucidate a new function for the condensin I complex in the maintenance of pericentromeric chromatin rigidity. In addition, the dynamic chromatin association of condensin I reveals that this complex cannot be trapping chromatin loops statically, as proposed in some of the current models but supports a model in which the assembly and maintenance of the mitotic chromosome involves a highly dynamic behavior of condensin I.

O estado condensado dos cromossomas mitóticos é fundamental para uma eficiente segregação do genoma durante a mitose. A condensação dos cromossomas permite não só a compactação física da cromatina mas também a resolução de problemas topológicos como concatâmeros existentes entre as cromátidas irmãs e entre diferentes cromossomas. Os complexos condensina I e II são importantes factores envolvidos na formação dos cromossomas mitóticos. Contudo, a sua exacta contribuição, bem como os mecanismos moleculares envolvidos, não são ainda completamente compreendidos. O trabalho apresentado nesta tese teve como principal objectivo alargar o conhecimento do papel dos complexos condensina na estrutura dos cromossomas mitóticos em Drosophila melanogaster. A primeira parte da tese descreve a análise fenotípica de células de cultura S2, nas quais a subunidade do complexo condensina I Barren/CAP-H foi depletada. Os resultados mostram que os cromosomas mitóticos são capazes de condensar, mas não de resolver as cromátidas irmãs. Células depletadas de Barren/CAP-H apresentam defeitos na congressão para a placa metafásica os quais não se devem a uma incorrecta ligação dos cromosomas ao fuso mitótico mas sim a problemas estruturais na heterocromatina centromérica e pericentromérica. Após o estabelecimento de ligação bipolar, a cromatina centromérica, organizada na ausência de Barren/CAP-H, é incapaz de resistir às forças exercidas pelo fuso e sofre distorção irreversível. A segunda parte da tese reporta a análise in vivo do comportamento dinâmico do complexo condensina I durante as divisões sinciciais do embrião de Drosophila. Esta análise mostra que a proteina de fusão Barren-EGFP se associa à cromatina durante a profase, concomitantemente com o início da condensação dos cromossomas. A associação ocorre inicialmente na região centromérica, e posteriormente estende-se para os braços dos cromossomas, atingindo um máximo de acumulação durante metaphase/anaphase. Análises de FRAP indicam que a maior parte da proteina associada à cromatina se encontra em contínua troca de subunidades com o conteúdo citoplasmático durante prometafase/metaphase. A terceira parte descreve uma análise preliminar sobre a função do complexo condensina II em Drosophila a qual sugere que este complexo não está envolvido na organização dos cromosomas mitóticos. Os resultados apresentados revelam uma nova função para o complexo condensina I na manutenção da rigidez da cromatina pericentromérica. Adicionalmente, a dinâmica associação do complexo condensina I aos cromossomas demonstra que este complexo não se encontra estaticamente aprisionando a cromatina, como proposto em alguns modelos, e sugere um modelo no qual a formação dos cromossomas mitóticos envolve um comportamento altamente dinâmico do complexo condensina I.