Identification and characterization of candidate genes in Rheumatoid Arthritis

Abstract

A Artrite Reumatóide (AR), uma das doenças auto-imunes mais comuns afectando 1% da população mundial, é caracterizada por uma progressiva lesão articular originando deformações articulares e incapacidade motora. A natureza multifactorial da AR origina uma elevada heterogeneidade com combinações específicas entre um perfil genético e factores ambientais que influenciam a susceptibilidade, a gravidade e o desenvolvimento da doença. A heterogeneidade desta doença é demonstrada por diferentes especificidades de auto-anticorpos séricos, como o factor reumatóide (RF) e os anticorpos contra os antigénios das proteínas citrulinadas (ACPA), a resposta diferenciada ao tratamento e a variabilidade do quadro clínico. Mesmo se a etiologia da AR permanece desconhecida, a contribuição genética está estimada entre 50 a 60%. O locus do complexo maior de histocompatibilidade (locus HLA), o primeiro factor genético identificado como estando associado à doença, contribui entre 30 a 50% para a susceptibilidade genética global da AR. Externamente ao locus HLA, a mais forte associação genética descrita até ao ano de 2006 é um polimorfismo do gene proteína tirosina fosfatase, não receptor tipo 22 (PTPN22-1858T). Como tal, a identificação de genes que contribuem para a patologia desta doença é importante para a compreensão dos mecanismos biológicos subjacentes. Adicionalmente, vários estudos envolvendo a análise do nível de expressão génica a partir de células mononucleadas do sangue periférico (PBMCs) de pacientes de AR revelaram uma clara variação entre os perfis de expressão investigados, permitindo a identificação de mecanismos moleculares distintos implicados na patologia da AR. Numerosos factores ambientais de risco para a AR foram investigados, no entanto, o tabaco é o único factor que foi claramente confirmado. Em diferentes estudos, o tabaco foi descrito como factor de risco para pacientes que possuem RF ou ACPA exercendo aparentemente um efeito mínimo em pacientes que não possuem estes auto-anticorpos. Adicionalmente, uma elevada interacção ambiental foi observada entre os alelos de risco (SE, epítopo partilhado) do locus HLA-DR para a AR e o tabaco nos pacientes com RF ou ACPA. Consequentemente, estes resultados obtidos através de estudos genéticos epidemiológicos necessitam de explicações biológicas para os efeitos conjuntos dos factores genéticos e ambientais de risco para a AR. O objectivo deste trabalho é a identificação e caracterização de genes candidatos na AR utilizando diferentes abordagens genéticas e moleculares. Na primeira parte deste trabalho (capítulos 3 e 4), foram realizados vários estudos de associação e ligação genética com o intuito de identificar e/ou confirmar novos genes de susceptibilidade para a AR na população francesa e/ou europeia. Adicionalmente, o estudo de expressão de dois genes candidatos foi efectuado para completar a análise genética. A abordagem genética foi baseada em estudos de associação e de ligação de genes candidatos utilizando famílias trio (cada uma constituída por um paciente AR e pais saudáveis) de origem francesa e/ou europeia. Nestes estudos, confirmamos a associação e a ligação das regiões genéticas TRAF1-C5 e 6q23 com a AR, e demonstramos uma tendência para a associação e ligação da região genética 4q27 com a AR na população europeia. Adicionalmente, obtivemos resultados conclusivos que excluem uma implicação do gene PRKCH e do alelo PTPN22-1123G na susceptibilidade genética da AR na população caucasiana francesa. Similarmente, a associação ou ligação dos genes CASP7 (caspase 7), RANK e RANKL (receptor activador do factor nuclear - kappaB e o seu ligando) com a AR foi excluída na população caucasiana europeia. Para completar a análise genética, avaliamos igualmente os níveis de expressão dos genes PRKCH e CASP7. Os resultados obtidos demonstram que o ARNm do gene PRKCH é mais expresso nas PBMCs dos pacientes com AR comparativamente aos controlos saudáveis e que o ARNm da isoforma funcional ou não funcional do gene CASP7 é menos expresso nas PBMCs dos pacientes com AR comparativamente aos controlos saudáveis. Estes resultados confirmam o interesse dos estudos de expressão génica nesta doença. No capítulo 5, realizamos um estudo de expressão génica de grande amplitude utilizando 48.701 ADNc em PBMCs de pacientes e controlos saudáveis. Uma expressão diferencial de 339 genes referenciados (238 sub-expressos e 101 sobre-expressos) entre os dois grupos foi observada. Neste estudo, identificamos uma expressão excepcionalmente elevada dum conjunto de novos genes implicados em diferentes mecanismos imunitários na AR, tais como, processos pró-inflamatórios, actividade anti-microbiana, stress celular e funções imunnomoduladoras, contribuindo assim para a descoberta de novos dados relativamente aos mecanismos moleculares da AR. No capítulo 6, avaliamos a interacção entre factores genéticos, biológicos e ambientais em pacientes franceses com AR. Neste trabalho, observamos uma associação entre os alelos HLA SE e o tabaco nos pacientes com ACPA e uma tendência positiva na interacção entre o alelo HLA-DRB1*0401 e o tabaco nos pacientes com ACPA. Adicionalmente, observamos uma correlação entre a dose cumulativa de cigarros fumados e os níveis de ACPA detectados. Nenhuma associação entre o alelo PTPN22-1858T e o tabaco foi observada nos pacientes com ACPA. Com este estudo confirmamos o papel do tabaco na etiologia da AR. Finalmente, várias colaborações foram efectuadas com outros laboratórios. Estes estudos familiares ou caso-controlo foram realizados em genes de susceptibilidade para a AR em populações de diferentes origens étnicas (Anexos). Todas estas abordagens complementares permitiram a identificação de novos genes e a constatação de interacções gene-autoanticorpos-ambiente, contribuindo deste modo a uma melhor compreensão dos mecanismos patológicos da AR que podem conduzir a uma identificação de bio-marcadores inovadores no quadro duma melhoria dos métodos de diagnostico e terapia.