Diferenciação osteoblástica de células mesenquimatosas do tecido adiposo de rato na presença de purmorfamina

Abstract

O tecido adiposo, tal como o tecido ósseo, e derivado do mesenquima e contém estroma de suporte que pode ser facilmente isolado. Este estroma e uma fonte alternativa de células precursoras do mesenquima que possuem capacidade de renovação e diferenciação em diferentes tipos celulares, incluindo adipócitos, osteoblastos, condrócitos e mioblastos. Estas células têm um comportamento semelhante ao das células mesenquimatosas presentes na medula óssea e, assim, apresentam muitas aplicações clínicas potenciais, nomeadamente relacionadas com terapêuticas celulares de regeneração do tecido mesodérmico. O trabalho desenvolvido no âmbito deste estudo teve como objectivo estudar o padrão de proliferação e diferenciação osteoblástica de células mesenquimatosas isoladas de tecido adiposo de rato na presença de purmorfamina (2-(1-Naphthoxy)-6-(4-morpholinoanilino)-9-cyclohexylpurina), composto recente que parece estimular a diferenciação osteoblástica de células mesenquimatosas e, também, de células da linhagem osteoblástica. Em paralelo, o comportamento celular foi também estudado na presença de dexametasona, um indutor osteogénico clássico em sistemas in vitro. As células mesenquimatosas foram isoladas do tecido adiposo de ratos Wistar e cultivadas na presença de ácido ascórbico (50 μg/ml), β-glicerofosfato (10 mM) e purmorfamina (1 – 3 μM) ou dexametasona (10 nM). O comportamento celular foi estudado pela avaliação da viabilidade/proliferação e de parametros de diferenciação osteoblastica, como a actividade da fosfatase alcalina e a capacidade de formação de uma matriz extracelular mineralizada. Foram utilizados métodos bioquímicos e histoquímicos e observação das culturas por microscopia de luz e microscopia electrónica de varrimento. A purmorfamina causou um aumento da proliferação celular e uma indução muito significativa da actividade de fosfatase alcalina, mas não se observou deposição mineral. As culturas mostraram a presença de uma camada de células alongadas e organizadas em zonas de maior densidade celular. A presença de dexametasona resultou numa diminuição significativa da taxa de proliferação celular, formação de agrupamentos celulares bem definidos que apresentaram reacção histoquímica intensa para a fosfatase alcalina e, alguns deles, presença de depósitos mineralizados de fosfato de cálcio. A purmorfamina parece actuar como agonista da via de sinalização “Hedgehog”, que tem um papel importante no desenvolvimento de muitos tecidos e órgãos, incluindo o tecido ósseo. Assim, a modulação desta via pode, potencialmente, revestir-se de interesse terapêutico. Também, a purmorfamina pode constituir uma ferramenta farmacológica adicional na elucidação dos mecanismos envolvidos na diferenciação do tecido ósseo.

Adipose tissue, such as bone, is derived from the mesenchyma and contains stromal of support that can be easily isolated. This stroma is an alternative source of stem cells which has the capacity for renewal and differentiation into different cells types, including adipocytes, osteoblasts, chondrocytes and myoblasts. These cells have a behaviour similar to that of mesenchymal cells from the bone marrow and, thus, have many potential clinical applications, in particular related to cellular therapies for tissue regeneration. The aim of this work was to study the proliferation and osteoblastic differentiation of mesenquymal cells from rat adipose tissue in the presence of purmorphamine (2-(1-Naphthoxy)-6-(4-morpholinoanilino)-9-cyclohexylpurina), a recent compound that appears to stimulate the osteoblastic differentiation of mesenquymal cells and, also, cells of the osteoblastic lineage. In parallel, the cellular behaviour was also studied in the presence of dexamethasone, a classic in vitro osteogenic inducer. The mesenchymal cells were isolated from the adipose tissue of Wistar rats and cultured in the presence of ascorbic acid (50 μg/ml), β- glycerophosphate (10 mM) and purmorphamine (1 – 3 μM) or dexamethasone (10 nM). The cellular behaviour was assessed for cell viability/proliferation and osteoblastic parameters, such as alkaline phosphatase activity and ability to form a mineralized extracellular matrix, by biochemical and histochemical methods and observation by light and scanning electronic microscopy. Purmorphamine caused an increase of the cell proliferation and a significant induction of alkaline phosphatase activity, but mineral deposition was not observed. The cultures showed the presence of a layer of elongated cells organized in areas of higher density. The presence of dexamethasone resulted in a significant decrease of the cell growth rate, formation of well-defined cellular groupments which presented an intense staining for alkaline phosphatase and, some of then, the presence of calcium phosphate mineralized deposits.