NT3-TrkC system in the regulation of GABAergic synapses and inhibition/excitation balance.

Abstract

Neurotrophin 3 (NT3) is a neurotrophic factor involved in a broad extension of processes, like cell survival, neuronal arborization as well as synaptic plasticity. It acts mainly through its cognate receptor TrkC, activating three important pathways – MAPK/Erk, PI3K and PLCγ – that are responsible for the neurotrophin action in the different processes. In the adult brain, NT3 is expressed mainly in the cerebellum and hippocampus. On the other hand, TrkC expression is more widespread, but with strong expression also in the hippocampus. The NT3/TrkC system has been studied in the context of various pathologies, including anxiety- and fear-related disorders. The role of this system in these pathologies is highly associated with its control of synaptic and morphological plasticity.Synaptic plasticity refers to the capacity of neurons to control the strength or efficacy of synapses, for example through alterations in their functioning, morphology, and content following a stimulus. It is the process that underlies learning and memory. Synaptic plasticity can be long lasting or short lasting. Also, synapses can be strengthened – potentiation – or weakened – depression – and this can occur in excitatory as well as inhibitory synapses. The roles of the NT3/TrkC system on synaptic plasticity are still poorly understood. There is nonetheless some evidence supporting the regulation of excitatory synaptic and morphological plasticity. In most studies NT3 seems to promote an increase in the excitatory transmission. TrkC has also been shown to have an excitatory synaptogenic effect through the binding of PTPσ. However, the effect of this system on inhibitory synaptic plasticity is mostly unknown. There is nonetheless some evidence showing that NT3 can also promote inhibitory synaptic activity. This suggest a that this system may have an homeostatic role, regulating the excitatory/inhibitory (E/I) balance.The balance between excitatory and inhibitory neuronal activity is crucial for the normal development and function of the brain. This balance can be maintained across different brain regions, at the level of the neuronal populations, as well as in individual neurons by their synapses. Dysregulations of this balance have been associated with a series of complications, namely in anxiety-related disorders.Considering that little is known about how NT3 regulates inhibitory synaptic transmission, and its potential in the regulation of E/I balance, we thought important to shed a light on this process. Thus, we recurred to the MEA system to assess NT3 ability to modulate neuronal activity. We observed that NT3 promoted an increase in neuronal activity, that was dependent on both GABAA receptors and GluN2B-containing NMDA receptors. Another interesting finding is that NT3 could rescue, to some extent, the network burst percentage, a metric of local synchronization when GABAA receptor transmission was inhibited. As little is known about NT3/TrkC action on inhibitory synapses, we characterized the presence of TrkC in inhibitory synapses with NT3 stimulation. We found that in our control conditions around 40% of inhibitory synapses contained TrkC. However, NT3 stimulation for 6 hours, promotes a general decrease in surface TrkC, not specific to synapses, which we attributed to the internalization of the receptors. We also observed that NT3 does not seem to have an inhibitory synaptogenic effect.Lastly, as we observed that NT3 acted on neuronal activity through GABAA receptor transmission, we characterized the surface localization of γ2-containing GABAA receptors following NT3 stimulations. We observed that 6 hours of NT3 stimulation promoted a synaptic localization of the receptors. We attribute this finding to a possible suppression of the lateral diffusion of the γ2-containing GABAA receptors promoted by the activation of the PLCγ pathway by the NT3/TrkC system, leading to an enhancement of inhibitory synaptic transmission.

Neurotrofina 3 (NT3) é um fator neurotrófico envolvido numa vasta variedade de processos, entre os quais sobrevivência celular, a arborização neuronal e a plasticidade sináptica. Atua principalmente através do seu recetor TrkC, ativando três vias importantes - MAPK/Erk, PI3K e PLCγ - que são responsáveis pela ação da neurotrofina nos diferentes processos. No cérebro adulto, NT3 é expressa principalmente no cerebelo e no hipocampo. Por outro lado, a expressão de TrkC é mais ampla, mas com forte expressão também no hipocampo. O sistema NT3/TrkC tem sido estudado no contexto de várias patologias, incluindo perturbações relacionadas com a ansiedade e o medo. O papel deste sistema nestas patologias está muito associado com o controlo da plasticidade sináptica e morfológica.A plasticidade sináptica refere-se à capacidade dos neurónios de controlar a força, ou eficácia das sinapses, por exemplo, através de alterações no seu funcionamento, morfologia e conteúdo em resposta a um estímulo. É o processo que está na base da aprendizagem e da memória. A plasticidade sináptica pode ser de longa ou curta duração. Além disso, as sinapses podem ser reforçadas - potenciação - ou enfraquecidas - depressão - e isto pode ocorrer tanto nas sinapses excitatórias como nas inibitórias.Os papéis do sistema NT3/TrkC na plasticidade sináptica são ainda pouco conhecidos. Existem, no entanto, algumas evidências que apoiam a regulação da plasticidade sináptica excitatória e morfológica. Na maioria dos estudos, NT3 parece promover um aumento da transmissão excitatória. Foi também demonstrado que TrkC tem um efeito sinaptogénico excitatório através da ligação com PTPσ. No entanto, o efeito deste sistema sobre a plasticidade sináptica inibitória é praticamente desconhecido. Contudo, há algumas evidências que mostram que o NT3 pode também promover a atividade sináptica inibitória. Isto sugere que este sistema pode ter um papel homeostático, regulando o equilíbrio excitatório/inibitório (E/I).O equilíbrio entre a atividade neuronal excitatória e inibitória é crucial para o desenvolvimento e o funcionamento normais do cérebro. Este equilíbrio pode ser mantido em diferentes regiões cerebrais, ao nível das populações neuronais, bem como em neurónios individuais através das suas sinapses. As desregulações deste equilíbrio têm sido associadas a uma série de complicações, nomeadamente em perturbações relacionadas com a ansiedade.Considerando que pouco se sabe sobre como NT3 regula a transmissão sináptica inibitória e o seu potencial na regulação do equilíbrio E/I, considerámos importante estudar sobre esse processo. Desse modo, recorremos ao sistema MEA para avaliar a capacidade de NT3 em modular a atividade neuronal. Observámos que NT3 promoveu um aumento da atividade neuronal, dependente tanto dos recetores GABAA como dos recetores NMDA contendo GluN2B. Outra descoberta interessante é que NT3 conseguiu resgatar, até certo ponto, a percentagem de disparos contínuos em rede neuronal, uma métrica de sincronização local, quando a transmissão através do recetor GABAA foi inibida.Como pouco se sabe sobre a ação de NT3/TrkC nas sinapses inibitórias, caracterizámos a presença de TrkC nas sinapses inibitórias com estimulação de NT3. Verificámos que, nas nossas condições de controlo, cerca de 40% das sinapses inibitórias continham TrkC. No entanto, a estimulação com NT3 durante 6 horas, promove uma diminuição geral de TrkC na superfície, não específica das sinapses, que atribuímos à internalização dos recetores. Observámos também que NT3 não parece ter um efeito sinaptogénico inibitório.Por fim, como observámos que NT3 atuava sobre a atividade neuronal através da transmissão dos recetores GABAA, caracterizámos a localização superficial dos recetores GABAA contendo a subunidade γ2 após estímulos com NT3. Observámos que 6 horas de estimulação com NT3 promoveram uma localização sináptica dos recetores. Atribuímos essa descoberta a uma possível supressão da difusão lateral dos recetores GABAA contendo γ2, promovida pela ativação da via PLCγ, pelo sistema NT3/TrkC, levando a um aumento da transmissão sináptica inibitória.