Phylogeny of Southern Ocean squid

Abstract

The Southern Ocean surrounding the Antarctic continent is a region characterised by its high degree of species diversification and endemism, largely due to the separation of the Antarctic continent from South America. This isolation has led to the evolution of endemic species, particularly known among fish and crustaceans. Additionally, global environmental changes have been shown to significantly influence Southern Ocean oceanic conditions. Understanding whether these environmental changes, under an evolutionary context, correlate with biological behaviour is crucial. Therefore, phylogenetic studies, by exploring the evolutionary history and relationships among organisms, are essential.Within marine organisms, cephalopods are known for their exceptional environmental plasticity and ability to adapt rapidly to changing conditions, playing a crucial role in marine ecosystems worldwide. In the Southern Ocean, cephalopods serve as food source for a variety of predators. Sampling efforts for cephalopods face significant challenges, with limited research cruises targeting these species and pelagic nets often failing to collect medium to large-sized squid specimens. The use of beaks collected from predators’ guts has been a reliable alternative to obtaining knowledge of this group. Therefore, beak morphology has been established as the standard metric for species identification, although only a few experts are capable of doing so. Molecular analysis could facilitate beak identification and lead the way to more knowledge of Southern Ocean squid while understanding their phylogenetic relationships.In this study, molecular techniques were applied to cephalopod samples to optimize DNA extraction from beaks, facilitating future taxonomic and food web studies. Additionally, this study aimed to infer evolutionary events and potential past colonization patterns in the Southern Ocean of squid whose phylogenetic information is poorly known. Therefore, beaks from various collection methods, storage conditions and cleaning processes were cut into three predetermined sections (total samples: 103 samples), followed by their DNA extraction and sequencing of Cytochrome oxidase I (COI) gene. The success rate for species identification was 64.1% (66/103) for samples and 77.1% (27/35) for beaks. There were no statistical differences between beak sections, though albatross showed the worst identification results and bleach treatment negatively affected the outcomes. This study presents the first detailed methodology for successfully extracting DNA from cephalopod beaks, from a variety of origins and obtaining high-quality DNA sequences for species identification.To infer intraspecific variation within species, a Neighbour-Joining tree based on 32 COI sequences representing 11 Southern Ocean squid species was built. Analysis retrieved monophyly at the species and family levels. The p-distance analysis indicated low intraspecific divergence among Southern Ocean squids. A Maximum-Likelihood tree was built to study relations between the different families of Southern Ocean squid. Using the same 32 COI samples, squid species demonstrated monophyly at the species and family levels once again. However, the tree lacked support for inner nodes due to limitations in the loci used. In this thesis, it was also discussed what the future of Southern Ocean’s squid phylogeny studies could aim for. Investigation of specific families is of particular interest to understanding evolution toward the Southern Ocean. Moreover, circumpolar analysis of intraspecific variation across different species could shine a light on the future of this group under environmental changes.

O Oceano Austral, que rodeia o continente Antártico, é uma região caracterizada pelo seu elevado grau de diversidade de espécies incluindo alguns endemismos, em grande parte devido à separação da Antártida da América do Sul. Este isolamento levou à evolução de espécies endémicas, particularmente entre grupos marinhos, como peixes e crustáceos. As alterações climáticas globais têm demonstrado influenciar significativamente as condições oceânicas, pelo que compreender se estas mudanças ambientais estão correlacionadas com os eventos biológicos é crucial. Assim, os estudos filogenéticos permitem explorar a história evolutiva e as relações entre organismos sendo, portanto, essenciais neste contexto.Entre os organismos marinhos, os cefalópodes são conhecidos pela sua excecional plasticidade ambiental e capacidade de se adaptarem rapidamente a condições variáveis, desempenhando um papel crucial nos ecossistemas marinhos de todo o mundo. No Oceano Antártico, os cefalópodes servem de fonte de alimento a uma variedade de predadores. No entanto, os esforços para a amostragem de cefalópodes enfrentam desafios consideráveis, dado que cruzeiros de investigação dirigidos a estas espécies são limitados. Adicionalmente, as redes pelágicas por estas utilizadas revelam-se, frequentemente, incapazes de capturar espécimes de médio a grande porte. A utilização de bicos recolhidos das vísceras dos predadores tem sido uma alternativa fiável para obter conhecimentos sobre este grupo. Por conseguinte, a morfologia dos bicos é considerada a métrica padrão para a identificação de espécies, embora apenas alguns especialistas sejam capazes de o fazer. Análises moleculares poderiam facilitar a identificação do bico e abrir caminho para um maior conhecimento das lulas do Oceano Austral, ao mesmo tempo que ajudariam a compreendem as suas relações filogenéticas.Neste estudo, foram aplicadas técnicas moleculares a amostras de cefalópodes para otimizar a extração de ADN dos bicos, facilitando futuros estudos taxonómicos e da cadeia alimentar. Adicionalmente, pretendeu-se inferir eventos evolutivos e potenciais padrões de colonização passada no Oceano Antártico de lulas cuja informação filogenética é pouco conhecida. Assim, bicos provenientes de vários métodos de recolha, condições de armazenamento e processos de limpeza foram cortados em três secções pré-determinadas (total de amostras: 103 amostras), seguindo-se a sua extração de ADN e sequenciação do gene citocrómo oxidase I (COI). A taxa de sucesso na identificação das espécies foi de 64,1% (66/103) para as amostras e de 77,1% (27/35) para os bicos. Não se verificaram diferenças estatísticas entre as secções dos bicos, no entanto, o albatroz apresentou os piores resultados de identificação, entre os diferentes bio-amostradores. Adicionalmente, o tratamento com lixívia afetou negativamente os resultados. Este estudo apresenta a primeira metodologia detalhada para extrair com sucesso DNA de bicos de cefalópodes, de uma variedade de origens, e obter sequências de DNA de alta qualidade para identificação de espécies.Para inferir a variação intra-específica dentro das espécies, foi construída uma árvore Neighbour-Joining baseada em 32 sequências de COI representando 11 espécies de lulas do Oceano Austral. A análise revelou monofilía ao nível da espécie e da família. A análise da distâncias-p indicou uma baixa divergência intra-específica entre as lulas do Oceano Austral. Foi construída uma árvore de Maximum-Likelihood para estudar as relações entre as diferentes famílias de lulas do Oceano Austral. Utilizando as mesmas 32 amostras de COI, as espécies de lulas demonstraram, mais uma vez, monofilía ao nível das espécies e das famílias. No entanto, a árvore não apresentou suporte para os nós internos devido a limitações nos loci utilizados.Nesta tese, foram ainda discutidos os objetivos futuros dos estudos de filogenia das lulas do Oceano Austral, sendo a investigação de famílias específicas de fucral importância para compreender a evolução das mesmas em direção ao Oceano Austral. Além disso, a análise circumpolar da variação intra-específica entre diferentes espécies poderá esclarecer o futuro deste grupo no âmbito das mudanças ambientais.