Modulation of Glutamine Metabolism and its relevance to reverting imatinib resistance in CML- an in vitro study

Abstract

Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative neoplasm characterized by the presence of the BCR-ABL1 fusion gene. This molecular event is the therapeutic target of imatinib, a tyrosine kinase inhibitor (TKI), used as a first-line treatment. Despite the success obtained after its introduction, a relevant percentage of cases, 20-30%, develop resistance to imatinib. There are different molecular mechanisms associated with imatinib resistance that open the opportunity for new target therapies to overcome resistance, for example, imbalance of drug transporters and metabolic alterations. Metabolic reprogramming is a cancer hallmark, and an increase in glutamine metabolism, namely in glutaminolysis, is one of these alterations. This pathway is an anaplerotic reaction, providing intermediates for the tricarboxylic acid cycle and is also responsible for the synthesis of amino acids, nucleotides and fatty acids. Many studies have shown the importance of this pathway to sustain the high proliferative and biosynthetic needs of cancer cells. Glutaminolysis may work as a compensatory metabolic mechanism for the development of neoplasias, but it can also be used by cancer cells to resist drug effects. To counteract this, different glutamine metabolism inhibitors have been tested in several types of cancer. However, the potential of these types of drugs in CML is little explored, especially in cases of imatinib resistance.This work aimed to assess the therapeutic potential of Telaglenastat (CB-839), a glutaminase inhibitor, in in vitro models of CML sensitive and resistant to imatinib.For this purpose, three CML cell lines were used: the K562 cells sensitive to imatinib and two imatinib-resistant cell lines, the K562-RC and K562-RD cells. The effect of Telaglenastat on the metabolic activity of cell lines was evaluated by resazurin assay. The cytotoxic effect of this drug was assessed by flow cytometry (FC), using annexin V/7-aminoactinomycin D (7-AAD), and by optical microscopy after May-Gründwald Giemsa staining. The impact of Telaglenastat on the cell cycle was evaluated by FC using the propidium iodide (PI)/RNase assay. The mitochondrial membrane potential (ΔΨmit), the intracellular levels of peroxides and superoxide anion, and the levels of reduced glutathione (GSH) were also determined by FC using JC-1, DCFH2-DA, DHE, and MO probes, respectively. The statistical analysis was performed considering a significance level of p<0.05. Telaglenastat reduced the metabolic activity in a time-, dose- and cell line-dependent manner. The imatinib-resistant cell lines demonstrated a higher sensitivity to Telaglenastat, with an IC50 (half-maximal inhibitory concentration) at 48 hours of 0.75 μM in K562-RD cells and of 4.9 μM in K562-RC cell line, compared to imatinib-sensitive cells where the IC50 is 85.8 μM. The drug triggers apoptosis as the mechanism of cell death in all cell lines. In the K562-RD cell line, a cell cycle arrest in the S phase was observed when treated with Telaglenastat. This glutaminase inhibitor promotes not only the increase in intracellular peroxide (in the K562 cell line) and superoxide anion levels (in K562 and K562-RD cell lines) as well as higher levels of GSH in all the cell lines in study. The ROS/GSH ratio increased in the K562 cell line and decreased in the K562-RD cell line under Telaglenastat action, thus the K562 cell line showed an oxidative stress state when exposed to Telaglenastat, which can be related to the depolarization of mitochondrial membrane observed in these cells. Our results support that metabolic reprogramming and glutamine pathway represent important processes in carcinogenesis and as drug-resistant mechanisms in CML. Furthermore, Telaglenastat reveals therapeutical potential in CML cell lines, particularly in cases of imatinib resistance. This drug may constitute an alternative therapeutic approach in CML, but more studies are needed.

A Leucemia Mielóide Crónica (LMC) é uma neoplasia mieloproliferativa caracterizada pela presença do gene de fusão BCR-ABL1. Esta característica molecular é o alvo terapêutico do imatinib, um inibidor de tirosina cinase, usado como primeira linha de tratamento. Apesar do sucesso obtido depois da sua introdução, uma percentagem relevante de casos, 20-30%, desenvolvem resistência ao imatinib. Existem diferentes mecanismos moleculares associados à resistência ao imatinib, que abrem oportunidades para novos alvos terapêuticos para ultrapassar a resistência, por exemplo, desequilíbrio dos transportadores de fármaco e alterações metabólicas. A reprogramação metabólica é uma característica do cancro, e um aumento no metabolismo da glutamina, nomeadamente a glutaminólise, é uma dessas alterações. Esta via é uma reação anaplerótica, providenciando intermediários para o ciclo dos ácidos tricarboxílicos e é também responsável pela síntese de aminoácidos, nucleótidos e ácidos gordos. Muitos estudos têm mostrado a importância desta via para sustentar as elevadas necessidades biossintéticas e proliferativas das células tumorais. A glutaminólise pode funcionar como um mecanismo metabólico compensatório para o desenvolvimento de neoplasias, mas também pode ser usado pelas células tumorais para resistir aos efeitos de fármacos. Para contrariar isto, diferentes inibidores do metabolismo da glutamina têm sido testados em vários tipos de cancro. Contudo, o potencial deste tipo de fármacos está pouco explorado em LMC, especialmente em casos de resistência ao imatinib. Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial terapêutico do Telaglenastat (CB-839), um inibidor da glutaminase, em modelos in vitro de LMC sensível e resistente ao imatinib.Para este propósito, foram usadas três linhas celulares: a linha celular K562, sensível ao imatinib, e duas linhas resistentes, as células K562-RC e K562-RD. O efeito do Telaglenastat na atividade metabólica das linhas celulares foi avaliado pelo ensaio da resazurina. O efeito citotóxico deste fármaco foi avaliado por citometria de fluxo (FC), usando a dupla marcação com Anexina V/7-aminoactinomicina (7-AAD), e por microscopia ótica depois da coloração de May-Gründwald Giemsa. O impacto do Telaglenastat no ciclo celular foi avaliado por FC usando iodeto de propídio (PI)/RNase. O potencial de membrana mitocondrial (ΔΨmit), os níveis de peróxidos intracelulares e anião superóxido e os níveis de glutationa reduzida foram também determinado por FC usando as sondas JC-1, DCFH2-DA, DHE e MO, respetivamente. A análise estatística foi realizada considerando um nível de significância de p<0.05. Telaglenastat reduziu a atividade metabólica de uma forma dependente do tempo, dose e linha celular. As linhas celulares resistentes ao imatinib demonstraram uma sensibilidade maior para o Telaglenastat, com um IC50 (metade da concentração inibitória máxima) às 48 horas de 0,75 μM nas células K562-RD e de 4,9 μM na linha celular K562-RC, comparativamente com as células K562, onde o IC50 é de 85,8 μM. O fármaco induziu apoptose como mecanismo de morte celular em todas as linhas celulares. Nas células K562-RD, foi observada uma paragem do ciclo celular na fase S quando tratadas com Telaglenastat. Este inibidor promoveu não apenas o aumento dos níveis de peróxidos intracelulares (na linha celular K562) e de anião superóxido (nas linhas celulares de K562 e K562-RD), como também aumentou os níveis de glutationa reduzida de todas as linhas celulares em estudo. A razão ROS/GSH aumentou na linha celular K562 e diminuiu na linha celular K562-RD com a ação do Telaglenastat, assim a linha celular K562 apresentou um estado de stresse oxidativo quando exposto ao Telaglenastat, que pode estar relacionado com a despolarização da membrana mitocondrial observado nestas células. Estes resultados suportam que a reprogramação metabólica e a via da glutamina representam importantes processos na carcinogénese e como mecanismo de resistência a fármacos em LMC. Além disso, o Telaglenastat revelou potencial terapêutico nas linhas celulares de LMC, particularmente em casos de resistência ao imatinib. Este fármaco pode constituir uma abordagem terapêutica alternativa em LMC, mas mais estudos são necessários.