Development of Bioreactor Systems for Plant-Derived Metabolite Production in Tamarillo (Solanum betaceum Cav.)

Abstract

This thesis delves into optimizing plant cell suspension cultures derived from Solanum betaceum Cav., commonly known as tamarillo, a species originating from the South American Andean region and recognised by its economic importance and nutritional properties. By establishing suspension cultures from induced callus lines and subjecting them to stress conditions elicited with different molecules, the study aims to unravel the intricate interplay between elicitation, cellular responses regarding growth and viability, and biocatalyst production dynamics.Plant cell suspension cultures are a versatile tool widely employed in biotechnological research to decode cellular and molecular processes, synthesise metabolites, and investigate differentiation pathways. By circumventing the structural complexity inherent to intact plants, these cultures offer a simplified but representative system for studying various aspects of plant cell biology. One main application of plant cell suspension cultures is the production of specialized metabolites, such as biocatalysts, which can be used to manipulate cellular processes to enhance the yields of molecules in high demand.In this context, tamarillo cell suspension culture conditions were optimised, defining the best medium composition to enhance cell growth and viability and, simultaneously, the hydrolytic biocatalysts production associated with stress-induced defence mechanisms.Among the strategies used to boost metabolite production in plant cell cultures, the application of elicitors stands out as particularly effective. Elicitors are molecules capable of stimulating specific metabolic pathways, often those associated with defence mechanisms, thereby increasing the production of valuable compounds. It was shown that elicitors, particularly chitosan, play a crucial role in enhancing the synthesis of hydrolytic enzymes, such as proteases and glycoside hydrolases, which have widespread industrial applications ranging from food processing to bioremediation.For the first time, liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was applied to analyse the intricate proteome dynamics of tamarillo cell suspension cultures under stress. Through this analysis, we were able to uncover a cascade of molecular events triggered by chitosan elicitation, including the upregulation of defence-related enzymes like peroxidases and superoxide dismutase (SOD), alongside the overproduction of biocatalysts like proteases, crucial for various industrial processes. Furthermore, tamarillo cell suspension cultures were upscale from a laboratory scale in Erlenmeyer flasks to a bioreactor system. This transition enhances biomass production and provides a controlled environment for optimal biocatalyst production. By optimizing the reactor architecture and the aeration strategies and ensuring proper mixing, potential challenges associated with shear stress and oxygen supply were overcome, thereby promoting the overall performance of the suspension cultures. Also, with LC-MS/MS, it was possible to profile the proteomic response of these cultures to the bioreactor environment, understanding how the operational conditions used could influence the culture proteomic response.The findings from this investigation shed light on the intricate mechanisms of the response of tamarillo cell suspension cultures to elicitation and offer practical insights into optimizing suspension culture conditions for enhanced biocatalyst production. Moreover, the successful upscale of these suspension cultures underscores this approach's scalability and industrial potential, paving the way for sustainable biocatalytic solutions in various sectors. Ultimately, this study represents a significant step forward in harnessing the untapped potential of plant cell suspension cultures for biotechnological applications, with tamarillo emerging as a promising biofactory for producing valuable biocatalysts that can be used to overcome the future challenges facing Humanity.

Esta tese investiga a otimização de culturas celulares em suspensão de Solanum betaceum Cav., conhecida como tamarilho, espécie originária da região andina sul-americana e reconhecida pela sua importância económica e propriedades nutricionais. O estabelecimento de culturas em suspensão a partir de linhas de calos previamente induzidas e a sua submissão a condições de stress promovido pelo uso de elicitadores , visa desvendar a intrincada interação entre a elicitação e as respostas celulares em relação ao crescimento e viabilidade bem como a dinâmica de produção de biocatalisadores.As culturas em suspensão de células vegetais são uma ferramenta versátil amplamente utilizada na investigação biotecnológica para decifrar processos celulares e moleculares, sintetizar metabolitos e investigar vias de diferenciação. Ao contornar a complexidade estrutural inerente às plantas intactas, estas culturas oferecem um sistema simplificado mas representativo para estudar vários aspectos da biologia celular vegetal. Uma aplicação principal destas culturas é a produção de metabolitos especializados, como biocatalisadores, que podem ser utilizados para manipular processos celulares e assim aumentar o rendimento na produção de moléculas com elevada procura.Neste contexto, as suspensões celulares de tamarilho foram otimizadas, definindo as condições de cultura promotoras do crescimento e viabilidade, bem como o estímulo à produção de enzimas hidrolíticas associadas aos mecanismos de defesa da planta induzidos pelo stress. De entre as estratégias utilizadas para estimular a produção de metabolitos, a elicitação destaca-se como particularmente eficiente. Elicitadores são moléculas capazes de estimular uma via metabólica específica, muitas vezes associada aos mecanismos de defesa, promovendo assim a produção de metabolitos associados de elevado interesse. Foi demonstrado que a utilização de elicitadores, em particular a utilização de quitosano, desempenha um papel central na optimização da síntese de enzimas hidrolíticas, tais como proteases e glicosil hidrolases, cuja utilização industrial é corrente em indústrias tão diversas como o processamento de alimentos, tratamento de resíduos ou bioremediação.Este estudo utiliza pela primeira vez a espectrometria de massa por cromatografia em fase líquida (LC-MS/MS), para descodificar a dinâmica proteómica das suspensões celulares de tamarilho sob condições de stress. Através desta análise, foi possível identificar a sequência de mecanismos moleculares espoletados pela elicitação com quitosano, particularmente a identificação das enzimas associadas aos mecanismos de defesa que se encontram sobre-produzidas nessas condições. Aqui destacamos particularmente a identificação de enzimas como peroxidases e superóxido dismutase (SOD) a par de diversas proteases, com a já referida aplicação industrial .Para além do já descrito, foi ainda realizado o escalamento destas suspensões celulares de frascos Erlenmeyer para bioreactores de maior volume. Esta transição permite o estabelecimento das culturas em suspensão num ambiente mais controlado, facilitador da produção de biomassa e promotor do rendimento na produção de biocatalisadores de interesse. A optimização prévia da arquitetura do bioreactor, das suas condições de aeração e fornecimento de oxigénio, bem como das condições para uma distrtibuição eficiente de todos os elementos no meio de cultura, permitiu a ultrapassar os maiores desafios inerentes a este escalamento, nomeadamente o fornecimento efetivo de oxigénio às células em cultura bem como as consequências da sua sujeição ao shear stress resultante da dinâmica interna do reator. Recorrendo mais uma vez à LC-MS/MS, foi possível estabeler o perfil da resposta proteómica das suspensões celulares de tamarilho nas condições de cultura em bioreactor, percebendo assim como as mesmas a podem influenciar.Os resultados deste trabalho procuram esclarecer os intirncados mecanismos de resposta das suspensões celulares de tamarilho à elicitação, bem como oferecem uma perspectiva prática para produção otimizada de biocataliosadores de interesse. Além disso, o sucesso do escalamento destas suspensões para bioreatores de maior volume abre o caminho para a sua potencial exploração como solução industrial para a produção de moléculas de elevado interesse de forma mais sustentável.Em última análise, este estudo apresenta um avanço significativo na exploração do até agora subaproveitado imenso potencial das culturas em suspensão de células vegetais, bem como para a sua aplicação biotecnológica, emergindo o tamarilho como um sistema promissor para a produção de biocatalisadores de interesse, ferrementas essenciais para superar os desafios futuros com que se confornta a Humanidade.