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Title: Estudo de novas formulações para regeneração óssea em defeitos de dimensão crítica
Authors: Palma, Paulo Jorge Rocha da 
Orientador: Guerra, Fernando Alberto Deométrio Alves
Ramos, João Carlos Tomás
Keywords: Regeneração do osso; Materiais biocompatíveis
Issue Date: 21-Sep-2009
Abstract: Estudo de novas formulações para regeneração óssea em defeitos de dimensão crítica Paulo Jorge Rocha da Palma Coimbra 2009 Resumo: Regenerar o osso perdido ou reabsorvido, é uma das grandes preocupações e desafios do Médico Dentista, necessitando muitas vezes da aplicação de um Biomaterial que permita uma boa regeneração óssea e tecidular. Com o objectivo de promover modalidades biológicas que possam estimular a regeneração óssea, têm vindo a ser desenhadas várias estratégias biomiméticas recorrendo à utilização de materiais o mais análogos possíveis à matriz óssea, culminando com o desenvolvimento de matrizes minerais naturais, enriquecidas com moduladores biológicos. Nesta perspectiva e deste esforço de optimização, surgiu um material particulado que representa a combinação de uma matriz mineral anorgânica de origem bovina (ABM) à qual está ligado, irreversivelmente, um peptídeo sintético (P-15). Este petídeo é um análogo da sequência existente no colagénio tipo I, 766GTPGPQGIAGQRGVV780, especificamente envolvido na estimulação da migração, adesão e proliferação celular de osteoblastos e fibroblastos, ou seja, no domínio da ligação celular. Recentemente e numa tentativa de melhorar o manuseamento clínico dos materiais, ou controlar a migração daqueles em partículas optimizando optimizar a sua eficácia clínica, foram desenvolvidas novas formulações deste material, recorrendo a veículos transportadores das partículas de ABM/P-15. A possibilidade de injectar o produto no defeito, mantendo-o no local desejado, sem necessidade de hidratação e compactação, representa um salto qualitativo importante nas propriedades de manuseamento deste material de enxerto ósseo. Porém, estas formulações apresentam um nível de evidência científica reduzido relativamente à avaliação das suas potencialidades regenerativas, assentando sobretudo em estudos in vitro. Deste modo, o trabalho experimental apresentado neste estudo foi concebido com o objectivo de analisar o processo de osteointegração e o potencial de regeneração óssea do ABM/P-15, num defeito ósseo de contenção física, comparando a formulação convencional de partículas isoladas, sem qualquer veículo de transporte, com novas formulações contendo diferentes sistemas de transporte e diferentes concentrações de partículas. Neste contexto, foram utilizados como veículos um hidrogel de carboximetilcelulose e glicerol, um hidrogel de hialuronato de sódio e ainda uma forma liofilizada deste último. Em paralelo, foi ainda utilizada uma formulação de osso cortical granulado e desmineralizado suspensa, também, numa matriz de hialuronato de sódio, obtida de animais da mesma espécie do modelo experimental, funcionando, pois, como um aloenxerto. Na realização deste trabalho experimental foi utilizada uma amostra constituída por trinta e dois coelhos (Oryctolagus cuniculus da estirpe “New Zealand White”, jovens machos adultos com um peso em redor de 3,8± 0,4 kg), divididos em períodos de avaliação às duas e quatro semanas. O côndilo do fémur foi a região anatómica escolhida para a realização dos defeitos e colocação das diferentes formulações do material em estudo. Seleccionou-se um modelo de cicatrização óssea de dimensão crítica, com defeitos de contenção física (5 mm de diâmetro por 10 profundidade). Este tipo de defeito representa uma forma adequada de determinar a verdadeira contribuição dos materiais de enxerto para formação de novo tecido ósseo. A avaliação dos processos de cicatrização óssea assentou essencialmente em estudos de índole histomorfológica, realizados em microscopia de luz e em análises histomorfométricas das lâminas histológicas, com o respectivo tratamento estatístico. O processamento histológico do material foi realizado no Laboratório de Tecidos Duros, do Departamento de Medicina Dentária da Faculdade de Medicina Dentária, Estomatologia e Cirurgia Maxilo-Facial da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra. As amostras foram preparadas seguindo um protocolo para material não descalcificado recorrendo ao sistema Exakt®. O processamento, com sistema Exakt® de alta precisão, representa uma técnica de excelência para a preparação histológica de tecidos duros não descalcificados. Assim, foi possível a aquisição de imagens histológicas com excelente qualidade, sem distorções morfológicas das estruturas a analisar e sem artefactos relevantes. Na análise histomorfométrica foram avaliados os seguintes parâmetros: a) quantificação da percentagem de partículas, b) quantificação da percentagem de novo osso, c) percentagem de novo osso versus partículas do enxerto e c) resolução do defeito. Na análise estatística utilizou-se o teste de Kruskal Wallis para a comparação entre os diferentes grupos (inter grupos) e o teste não paramétrico de Mann-Whitney para a avaliação intra grupos. Estas análises foram feitas com um nível de significância de 95% (p!0.05). Todas as formulações utilizadas mostraram uma adequada biocompatibilidade comprovada pela ausência de reacções adversas ou quaisquer alterações anatomo-patológicas dos tecidos envolventes. Os defeitos ósseos preenchidos com os diferentes materiais de enxerto apresentaram muito maior quantidade de novo osso comparativamente com os defeitos sem preenchimento (controlo negativo). De facto, nos defeitos ósseos sem preenchimento (Grupo I), ainda que no início se observe uma evolução no sentido da cicatrização óssea, não se registou em nenhum dos casos estudados um adequado encerramento do defeito, ficando muito longe disso. Com efeito, verificou-se sempre a presença de grande quantidade de tecido fibroso, justificando a sua denominação de defeito de dimensão crítica. Os defeitos ósseos preenchidos apenas com partículas de AMB/P-15 (Grupo II) foram sendo progressivamente ocupados por uma notável quantidade de tecido ósseo, seguindo um processo sequencial e centrípeto. Este material de enxerto promoveu a síntese de uma matriz óssea mineralizada, constituída inicialmente por uma rede trabecular de tecido imaturo, que evoluiu para um tecido ósseo mais organizado e funcionalmente mais activo, ligando as partículas entre se às paredes do defeito. Há que sublinhar, no entanto, a persistência de grandes áreas de tecido ósseo imaturo ainda não remodelado no final do período experimental. Este material de enxerto funcionou como um excelente suporte osteocondutor, que possibilitou e promoveu a síntese de uma matriz mineralizada, constituída inicialmente por uma rede trabecular de osso imaturo, que evoluiu em alguns locais, para um tecido ósseo lamelar. A composição química de uma matriz que se aproxima bastante da fase mineral do osso (ABM), juntamente com um biomodulador (P-15) e uma microestrutura de superfície com geometria e dimensões adequadas deverá favorecer e estimular a formação de tecido ósseo. As partículas de ABM/P-15 satisfazem estes requisitos, demonstrando neste estudo experimental uma boa capacidade osteocondutora e osteopromotora. A formulação de partículas de ABM/P-15 suspensas em hidrogel de carboximetilcelulose (ABM/P-15/CMC – grupo III) ao permitir uma migração anómala das partículas determinou uma osteocondução imprevisível e comprometeu a formação e maturação de uma matriz mineralizada robusta. Apresentando significância estatística em relação aos outros grupos (p<0.05) para formação do novo tecido ósseo. Este efeito migratório foi particularmente visível, aos quinze dias. Esta formulação, mesmo quando estável, apresentou um comportamento fracamente positivo na formação óssea. A migração das partículas observadas neste grupo experimental determinou uma dinâmica de instabilidade que teve certamente uma influência decisiva no comportamento deste material. Os ensaios realizados com partículas de ABM/P-15 suspensas numa matriz de hialuronato de sódio ABM/P-15/Hy (grupo IV) mostraram uma baixa concentração de partículas, aliada a uma certa tendência para a sua migração. A deposição de tecido ósseo seguiu e acompanhou a distribuição das partículas. As trabéculas ósseas que se apresentavam numa fase de maturação mais adiantada estavam geralmente associadas a áreas de maior concentração de partículas, estando também situadas mais perifericamente. Os estudos realizados com partículas de ABM/P-15 suspensas numa matriz de hialuronato de sódio liofilizado (ABM/P-15/Hy lio- grupo V) apresentaram o melhor desempenho biológico, considerado numa perspectiva de quantidade e de qualidade de tecido ósseo formado e da sua remodelação, associado a uma perfeita osteointegração das partículas. A sinergia resultante da combinação do ABM com o P-15 e com Hy irá certamente potenciar uma mais fácil invasão, crescimento e diferenciação das células da linha osteoblástica e osteoclástica, estimulando uma intensa formação e remodelação da matriz óssea, justificando os resultados obtidos com esta formulação. Pode afirmar-se por último que, apesar desta formulação apresentar o mesmo veiculo transportador (Hy) e a mesma constituição de partículas (ABM/P-15) do grupo anterior (ABM/P- 15/Hy), a liofilização fez toda a diferença na performance deste material. Os defeitos preenchidos com partículas de osso alógeno desmineralizado numa matriz de hialuronato de sódio (DBM/Hy - grupo VI) apresentavam muitas das partículas parcialmente e não totalmente descalcificadas. Este facto levou a comportamentos biológicos diferentes. O conjunto de estudos apresentados começa com a formação de um tecido ósseo que rapidamente atinge na periferia do defeito uma maturação notável, aos quinze dias. Porém, com o decorrer do tempo, observa-se um cada vez maior grau de desorganização e reabsorção do enxerto, particularmente notório nas partículas completamente desmineralizadas e localizadas no interior do defeito. Grande parte do tecido ósseo imaturo formado por aposição na superfície destas partículas não foi, no entanto, remodelado nem substituído por tecido lamelar, como era expectável aos trinta dias evolução. Este facto poderá estar relacionado com a instabilidade das partículas, não permitindo uma progressão eficaz do processo de regeneração óssea que parecia inicialmente tão promissor. A formulação utilizada neste grupo experimental integra um conjunto de variáveis (matriz óssea descalcificada, colagénio e ácido hialurónico), que isoladamente têm reconhecida actividade osteoindutora e osteopromotora, apresentando certamente a sua associação propriedades reforçadas, que podem ser potencializadas e optimizadas. Na análise histomorfométrica entre grupos, na percentagem de novo osso formado, aos 15 dias, verificamos que o Grupo V (AMB/P-15/Hy lio) e o Grupo VI (DBM/Hy) apresentam os melhores resultados, apesar de não apresentarem diferenças estatísticas entre si. Por outro lado, o Grupo III (AMB/P-15/CMC) exibiu os valores percentuais mais baixos, com diferenças significativas em relação a maiorias dos grupos, excepto com o Grupo IV (AMB/P-15/Hy). Notamos ainda, que o Grupo VI (DBM/Hy) apresentou significância estatística em relação ao Grupo IV (AMB/P-15/Hy), para percentagem de novo tecido ósseo. Na quantificação de tecido ósseo aos trinta dias constatou-se que o Grupo V (AMB/P-15/Hy lio) apresentou os melhores resultados com diferenças estatisticamente significativas a todos os outros, excepto ao Grupo II (AMB/P-15) e ao Grupo VI (DBM/Hy). Por sua vez, o Grupo III (AMB/P-15/CMC), destacou-se mais uma vez pelos resultados inferiores havendo significância estatística em relação a todos os outros grupos. Na análise intra-grupos, entre as duas e quatro semanas, os Grupos II (AMB/P-15) e V (AMB/P-15/Hy lio) apresentava verificou-se um aumento significativo na neoformação de tecido óssea. A capacidade de optimizar o espaçamento, a manutenção e distribuição tridimensional das partículas, proporcionada pelos veículos transportadores parece potenciar, guiar e suportar uma melhor e mais precoce invasão celular e angiogénica, necessárias ao desenvolvimento das actividades osteoblástica e osteoclástica. De todos estes veículos transportadores testados, o hialuronato de sódio (adicionado a partículas de ABM/P-15 ou de DBM) parece ser o único que aumenta o processo de regeneração óssea assim como a taxa de reabsorção do enxerto. Além disso, a formulação liofilizada exibe um melhor desempenho.
URI: http://hdl.handle.net/10316/11481
Rights: openAccess
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UC - Dissertações de Mestrado

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