Unveiling a new Cx43-dependent mechanism of plasma membrane repair required for vascular function

Abstract

Efficient plasma membrane repair mechanisms (PMR) have been evolutionary developed by cells to counteract membrane injuries that can compromise their function and viability. The chronic exposure to blood flow-related forces renders endothelial cells particularly prone to plasma membrane damage. Although it is conceivable that endothelial cells have evolved a highly efficient PMR system to cope with this stress-inducing environment, the underlying mechanisms and signalling pathways remain largely unknown. Underpinned in preliminary data suggesting that Connexin43 (Cx43), a protein canonically associated with gap junction-mediated intercellular communication, has a role in PMR, we aimed to explore in more detail whether Cx43 acts as a player in membrane repair response of endothelial cells upon plasma membrane injury, using a mouse cardiac endothelial cell (MCEC) line and resorting to diverse cellular and biology approaches. In this work, we showed that MCEC activate an extracellular calcium-dependent PMR response after membrane wounding elicited by different plasma membrane damage inducers, including the small holes elicited by the bacterial pore-forming toxin Streptolysin O (SLO). Grounded on the data gathered in this study we propose a model in which Cx43 participates in endocytosis-associated PMR of cardiac endothelial cells upon SLO-induced damage, instead of being involved in membrane repair processes that involves the outward budding of the plasma membrane. Altogether, this study establishes a new non-canonical role for Cx43 in PMR of endothelial cells and sheds some light on the Cx43-associated PMR mechanisms triggered by injured endothelial cells, linking key players of endocytosis and autophagy in this process. Of note, a deeper knowledge of the molecular players and mechanisms underlying PMR response of endothelial cells is of utmost importance to develop strategies that tackle membrane repair impaired-associated vascular disorders. Direct intercellular communication can be mediated by gap junctions but can also occur through tubular structures named tunnelling nanotubes (TNTs), which connect the cytoplasm of neighbouring cells and facilitate the transport of molecules, ions and pathogens. Although the formation of TNTs between cardiomyocytes has been reported, the effect of ischaemia on this process remains unclear. In this work, we also assessed the impact of ischaemia and oxidative stress on TNT-mediated communication between cardiac cells. Our data showed that cardiac cell lines and neonatal primary cultures of cardiomyocytes subjected to in vitro ischaemia form more TNTs than control cells. Moreover, antioxidants prevented ischaemia-induced TNT formation, suggesting that oxidative stress regulates this process. Furthermore, this work identified troponin T as a new specific marker of cardiomyocyte-derived TNTs, which allows for the identification of heterocellular TNT connections between cardiomyocytes and other resident cells in the heart, such as fibroblasts. Our results also revealed the presence of TNT-like structures in rat and human hearts. Rat hearts subjected to global ischaemia in the ex vivo Langendorff system showed increased formation of TNTs. Altogether, this study demonstrates that ischaemia affects the formation of TNTs in the heart and sheds new light on the disease-associated deregulation of communication between cardiac cells.

Mecanismos eficientes de reparação da membrana plasmática (RMP) têm sido evolutivamente desenvolvidos pelas células para eliminarem danos na superfície celular que possam comprometer a sua função e viabilidade. A exposição crónica a forças relacionadas com o fluxo sanguíneo torna as células endoteliais particularmente suscetíveis a danos na membrana plasmática. Embora seja expectável que as células endoteliais possuam um sistema de reparação da membrana plasmática eficiente para lidar com este ambiente indutor de stress, os mecanismos e vias envolvidas foram, até à data, pouco estudadas. Com base em resultados preliminares sugerindo que a conexina43 (Cx43), uma proteína canonicamente associada à comunicação intercelular mediada por gap junctions, tem um papel na RMP, pretendemos explorar em maior detalhe se a Cx43 participa na resposta de RMP de células endoteliais após dano na membrana plasmática, recorrendo a uma linha celular de células endoteliais cardíacas de ratinho (MCEC) e a diversas técnicas de indução de lesão e abordagens de biologia celular e molecular, para avaliação do dano causado. Neste trabalho, mostrámos que as MCEC ativam uma resposta de reparação da membrana plasmática dependente de cálcio extracelular após lesão da membrana causada por diferentes agentes, incluindo pequenos orifícios induzidos pela toxina bacteriana formadora de poros, a estreptolisina O (EO). Com base nos nossos dados, é mais provável que a Cx43 participe na RMP mediada por endocitose de células endoteliais cardíacas após dano induzido pela EO, em vez de estar envolvida em processos de reparação da membrana que envolvem a deformação da membrana plasmática para o espaço extracelular. De modo geral, este estudo estabelece um novo papel não canónico para a Cx43 na RMP de células endoteliais e desvenda alguns dos mecanismos de RMP associados a Cx43 desencadeados por células endoteliais com lesão na membrana plasmática, ligando componentes importantes envolvidos na endocitose e autofagia neste processo. É importante ressaltar que um conhecimento mais profundo dos elementos moleculares e mecanismos subjacentes à resposta de RMP das células endoteliais é de extrema importância para desenvolver estratégias que combatam os distúrbios vasculares associados ao comprometimento da reparação da membrana.A comunicação intercelular direta pode ser mediada por gap junctions, mas também pode ocorrer através de estruturas tubulares denominadas tunnelling nanotubes (TNTs), que conectam o citoplasma de células vizinhas e facilitam o transporte de diversos elementos celulares. Embora a formação de TNTs entre cardiomiócitos tenha sido já descrita, o efeito da isquemia neste processo permanece desconhecido. Neste trabalho avaliámos o impacto da isquemia e do stress oxidativo na comunicação mediada por TNTs entre células cardíacas. Os nossos resultados mostraram que em linhas celulares cardíacas e em culturas primárias de cardiomiócitos que foram sujeitos a isquemia in vitro são observados mais TNTs do que em células cardíacas mantidas em condições controlo. Além disso, antioxidantes preveniram a formação de TNTs induzida por isquemia, sugerindo que o stress oxidativo regula este processo. Este trabalho identificou um novo marcador específico de TNTs derivados de cardiomiócitos, a troponina T, o que permite a identificação de TNTs heterocelulares entre cardiomiócitos e outras células residentes no coração, como fibroblastos. Os nossos resultados também revelaram a presença de estruturas semelhantes a TNTs em corações de ratos e humanos. Corações de ratos submetidos a isquemia global usando o sistema ex vivo de Langendorff mostraram aumento da formação de TNTs. Este estudo demonstra que a isquemia afeta a formação de TNTs no coração, constituindo mais um passo para ajudar a esclarecer alguns mecanismos envolvidos na desregulação da comunicação entre as células cardíacas, em condições patológicas.