Staphylococcus aureus intracellular lifestyle: phenotypic profiles and underlying molecular determinants

Abstract

O Staphylococcus aureus (S. aureus) é um importante patógeno humano responsável por infeções nosocomiais e infeções adquiridas na comunidade, representando uma ameaça importante à vida humana. O amplo espectro e gravidade das doenças causadas por esta bactéria, aliado ao surgimento de estirpes multirresistentes a antibióticos, tem conduzido à escassez de opções terapêuticas, tornando esta bactéria uma das principais preocupações para a saúde pública em todo o mundo. A versatilidade deste patógeno é ilustrada pelos diversos mecanismos que lhe permitem evadir a resposta imunitária, bem como pela sua capacidade de produzir inúmeros fatores de virulência que contribuem para as manifestações clínicas das infeções causadas pelo S. aureus. Inicialmente considerado um patógeno extracelular, vários estudos demonstraram que o S. aureus pode também invadir, replicar e persistir no interior de células fagocíticas humanas profissionais e não profissionais, criando assim um nicho protector contra antibióticos e um reservatório para infeções crónicas e recorrentes. Embora o S. aureus seja cada vez mais reconhecido como um patógeno intracelular facultativo, a significância e a prevalência do seu estilo de vida intracelular bem como os fatores bacterianos que o regulam são amplamente desconhecidos.No presente trabalho, realizámos ensaios de infeção baseados em microscopia de fluorescência e análise de imagem automatizada para caracterizar a interação de 191 isolados clínicos de S. aureus, obtidos de pacientes com infeções ósseas/articulares, bacteremia e endocardite infeciosa, com quatro tipos de células hospedeiras (células epiteliais e endoteliais, osteoblastos e macrófagos), a cinco tempos após a infecção. Esta análise multiparamétrica revelou que a maioria dos isolados são internalizados, e que uma grande fração dos mesmos replica e persiste dentro das células hospedeiras, apresentando perfis de infeção distintos em células fagocíticas profissionais e não profissionais. Através de clusterização fenotípica, identificámos cinco grupos de isolados capazes de induzir infeções intracelulares distintas, nomeadamente um grupo que incluía isolados que apresenta uma elevada taxa de replicação intracelular e indução de morte tardia das células hospedeiras in vitro e in vivo. A caracterização deste grupo fenotípico revelou que estes isolados são deficientes na protease cisteínica staphopain A. Além disso, todos os isolados capazes de invadir células não fagocíticas, mas incapazes de escapar do vacúolo e replicar no citosol das células hospedeiras, apresentam um sistema agr não funcional. Para identificar os factores bacterianos que regulam as diferentes fases do estilo de vida intracelular do S. aureus, foram realizados ensaios de infeção baseados em microscopia de fluorescência com recurso à S. aureus Nebraska Transposon Mutant Library (NTML), que possuiu 1920 mutantes de S. aureus correspondentes a todos os genes bacterianos não essenciais. Os ensaios foram realizados em macrófagos e células epiteliais tendo-se avaliado a infeção dos vários mutantes a vários tempos após a infeção. Os nossos resultados demonstraram mudanças significativas nas diferentes características fenotípicas avaliadas entre os vários mutantes e a estirpe de referência, incluindo na invasão, na replicação intracellular, na persistência e na viabilidade das células hospedeiras. Foi também observada uma sobreposição mínima entre os mutantes de S. aureus que exibem fenótipos distintos de infeção intracelular nos dois tipos de células hospedeiras testadas. Mais ainda, validámos com sucesso subconjuntos específicos de mutantes do S. aureus que exibem perfis intracelulares distintos da estirpe de referência. No entanto, mais ensaios experimentais são necessários para caracterizar completamente os genes identificados e os mecanismos de ação subjacentes. É importante destacar que este estudo permitiu a associação de determinantes genéticos responsáveis pelos diferentes fenótipos intracelulares observados e os fenótipos exibidos pelos diferentes grupos fenotípicos de isolados clínicos de S. aureus identificados.Em suma, o estudo apresentado estabeleceu que o estilo de vida intracelular do S. aureus é uma característica prevalente da sua infecção o que pode trazer potenciais implicações para o tratamento eficaz de infeções causadas por esta bactéria. Este trabalho conduziu também à identifcação de factores bacterianos importantes para as várias etapas do processo de infecção intracelular do S. aureus. Numa perpectiva mais geral, este estudo pode contribuir para aumentar o nosso conhecimento relativo à interação entre o S. aureus e o seu hospedeiro e poderá ainda conduzir à identificação de potenciais alvos terapêuticos com o objectivo de inibir o estilo de vida intracelular desta bactéria durante uma infecção.

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a major human pathogen responsible for life-threatening nosocomial and community-acquired infections. The wide range and severity of staphylococcal diseases, coupled with the emergence of multi-drug resistant strains have led to a lack of therapeutic options, making this bacterium a major public health concern worldwide. The versatility of this pathogen is illustrated by the numerous mechanisms to counteract immune response and the ability to produce numerous virulence factors that contribute to the clinical manifestations of S. aureus. While initially considered an extracellular pathogen, several studies demonstrated that S. aureus can invade, replicate, and persist within a variety of human professional and non-professional phagocytic cells, providing a protective niche against antibiotics and a reservoir for chronic and recurrent infections. Although S. aureus is increasingly recognized as a facultative intracellular pathogen, the significance and pervasiveness of its intracellular lifestyle remain elusive and the genetic factors governing the various stages of this lifestyle are largely unknown.In the present work, we applied fluorescence microscopy-based infection assays and automated image analysis to profile the interaction of 191 S. aureus isolates from patients with bone/joint infections, bacteremia, and infective endocarditis, with four host cell types (epithelial and endothelial cells, osteoblasts, and macrophages), at five times post-infection. This multiparametric analysis revealed that almost all isolates are internalized, and that a large fraction of them replicate and persist within host cells, presenting distinct infection profiles in non-professional vs. professional phagocytes. Phenotypic clustering highlighted five groups of isolates with distinct intracellular fates, including one comprising isolates exhibiting high intracellular replication and inducing delayed host death in vitro and in vivo. Further characterization of these phenotypic group revealed that these isolates were deficient in the cysteine protease staphopain A. Additionally, all isolates capable of invading non-phagocytic cells but unable to escape the vacuole and replicate in the host cytosol were defective in the agr system.To uncover the genetic determinants governing different stages of S. aureus intracellular lifestyle, we performed fluorescence microscopy-based screenings using the S. aureus Nebraska Transposon Mutant Library (NTML), which comprises 1,920 distinct S. aureus mutant strains corresponding to virtually all non-essential bacterial genes. These screenings were conducted in macrophages and epithelial cells at multiple time-points after infection. Our multiparametric analysis revealed a considerable fraction of S. aureus mutants exhibiting significant changes in at least one of the main phenotypic features evaluated, including invasion, replication, persistence, and host cell viability. Comparative analysis of the screenings unveiled minimum overlap between the bacterial mutants exhibiting distinct intracellular infection phenotypes in the two host cell types. We successfully validated specific subsets of S. aureus mutants exhibiting distinct intracellular profiles. Notably, this study allowed the association of genetic determinants responsible for the observed intracellular phenotypes of S. aureus clinical isolates from different phenotypic clusters identified. However, further research is necessary to fully characterize theassociated genes and their underlying mechanisms of action. Overall, the present study established S. aureus intracellular lifestyle as a prevalent feature of infection, which holds potential implications for the effective treatment of staphylococcal infections. Furthermore, the identified genetic determinants associated with the various stages of S. aureus intracellular lifestyle can contribute to enhancing our understanding of the interaction between S. aureus and its host and offer potential targets for therapeutic interventions aimed at disrupting its intracellular lifestyle.