Crosstalk between neutrophils and endothelial cells in a context of Traumatic Brain injury: Role of CXCL8-CXCR2 axis

Abstract

Traumatic brain injury (TBI) is considered the leading cause of death and disability worldwide. TBI occurs due to various external mechanical forces, originating structural and functional changes that result in neuronal injuries, divided into primary and secondary brain injuries. The blood-brain barrier (BBB) dysfunction, excitotoxicity, brain edema, and neuroinflammation are some of the most described adverse effects of TBI. Despite its high prevalence, the therapies available at present have focused only on treating the acute effects. Thus, there is an urgent need to identify an effective strategy to counteract both the acute and chronic consequences that arise after a TBI. Neutrophils are the first cells of the peripheral immune system to infiltrate the trauma site and are intimately involved in the initiation, development, and resolution of TBI. Interestingly, elevated levels of CXCL8 have been detected in the cerebrospinal fluid of patients correlating with BBB dysfunction and increased mortality. The chemokine CXCL8 is an essential component of neutrophil transmigration and a powerful modulator of neuroinflammation in TBI through binding to its receptor CXCR2, the most important receptor in chemotaxis. This receptor is highly expressed by neutrophils and endothelial cells. Moreover, under basal conditions, CXCL8 appears to be present at low levels, but it is upregulated in pathological conditions.Thus, we hypothesize that the CXCL8-CXCR2 axis could be responsible for the chemotaxis of neutrophils, migrating from the bloodstream to the brain site, under TBI conditions. For this, we used a human endothelial cell line (hCMEC/D3) subjected to an elevated hydrostatic pressure (EHP) corresponding to 70mmHg above atmospheric pressure for 1h in a hyperbaric chamber. Our results showed that direct exposure to EHP leads to BBB hyperpermeability through transcytosis mediated by caveolae, with no alteration in clathrin-mediated endocytosis, nor on the paracellular trafficking (with no alterations in TEER values). Considering that caveolae are critical for transcytosis and Cav-1 is the major protein constituent of caveolae. We further evaluated the phosphorylation of Cav-1 at tyrosine residue Tyr14, necessary for vesicle formation. Importantly, we observe not only an increase in Cav-1 total protein levels but also in i t s p h o s p h o ry l a t e d f o r m . A f t e r t h a t , w e d i s c l o s e t h e p l a y e r s i n v o l v e d i n n e u t r o p h i l s ’ transmigration through BBB, using differentiated HL-60 (HL60 cells treated with 1.3% DMSO for 3 days). Importantly, the inhibition of caveolin’s vesicle formation fully prevented the transmigration of neutrophils, as well as, the inhibition of all NOX enzymes, or specifically NOX- 1 (preventing the formation of reactive oxygen species). Furthermore, we also observed that E- selectin and ICAM-1 are required for this migration. Finally, we demonstrated that inhibition of the CXCR2 receptor completely prevented the migration of neutrophils in conditions of TBI, as well as after direct incubation of endothelial cells with CXCL8, showing that activation of CXCR2 is a key step in this migration. Overall, our results suggest that the axis CXCL8-CXCR2 could have an impact on neutrophils migration across BBB under TBI conditions, as well as the transcellular transport could be the chosen pathway for the efflux of neutrophils into the brain, with the interaction of adhesion molecules (i.e., ICAM-1), and production of reactive oxygen species.

O traumatismo crânio encefálico (TCE) é considerado a principal causa de morte e incapacidade pelo mundo. O TCE ocorre devido a diversas forças mecânicas externas, originando alterações estruturais e funcionais que resultam em lesões neuronais, que podem ser divididas em lesões cerebrais primárias e secundárias. A disfunção da barreira hematoencefálica (BHE), a excitotoxidade, o edema cerebral e a neuroinflamação são alguns dos efeitos nefastos do TCE mais bem descritos. Apesar da sua elevada prevalência, as terapias disponíveis no momento têm se focado somente em tratar os efeitos agudos. Assim, torna-se urgente a necessidade de identificar uma estratégia efetiva que contrarie quer as consequências agudas quer as crónicas que surgem após um TCE. Os neutrófilos são as primeiras células do sistema imune periférico a infiltrar-se no local do trauma e estão intimamente envolvidos na iniciação, desenvolvimento e resolução do TCE. Curiosamente foram detectados níveis elevados de CXCL8 no líquido cefalorraquidiano de pacientes correlacionados com a disfunção da BHE e o aumento de mortalidade. A quimiocina CXCL8 é um componente essencial da transmigração dos neutrófilos e um poderoso modulador da neuroinflamação no TCE através da ligação ao seu receptor CXCR2, o receptor mais importante na quimiotaxia. Este receptor é altamente expresso pelos neutrófilos e células endoteliais, e em condições basais parece estar presente em níveis baixos. Por outro lado, os seus níveis estão aumentados numa situação de patologia.Assim, colocamos a hipótese de que o eixo CXCL8-CXCR2 poder ser responsável pela quimiotaxia dos neutrófilos para o local do trauma em condições de TCE. Para tal, utilizámos uma linha celular endotelial humana (hCMEC/D3) exposta a uma pressão hidrostática elevada (PHE) correspondente a 70mmHg acima da pressão atmosférica durante 1h numa câmara hiperbárica.Os nossos resultados mostraram que a exposição direta à PHE conduziu à hiperpermeabilidade da BHE através de transcitose mediada por cavéolas, sem alterações na endocitose mediada por clatrina, nem no tráfego paracelular (sem alterações nos valores de TEER). Considerando que a cavéola é fundamental para a transcitose e que a Cav-1 é a principal proteína constituinte da cavéola, avaliámos também a fosforilação da Cav-1 no resíduo de tirosina Tyr14, necessário para a formação de vesículas. É importante ressaltar que observamos não apenas um aumento nos níveis totais da proteína Cav-1, mas também na sua forma fosforilada. Em seguida, para percebermos quais os mediadores envolvidos na transmigração de neutrófilos através da BHE, utilizámos células HL-60 diferenciadas (células HL60 tratadas com DMSO 1,3% por 3 dias). A inibição da formação de vesículas de caveolina impediu completamente a transmigração de neutrófilos, bem como a inibição de todas as enzimas NOX, ou especificamente NOX-1 (impedindo a formação de espécies reactivas de oxigénio). Além disso, também observámos quea E-selectina e a ICAM-1 são necessárias para esta migração. Finalmente, demonstrámos que a inibição do recetor CXCR2 impediu completamente a migração de neutrófilos em condições de TCE, bem como após a incubação direta de células endoteliais com CXCL8, mostrando que a ativação do CXCR2 é um passo fundamental para esta migração. Em suma, os nossos resultados sugerem que o eixo CXCL8-CXCR2 poderá ter um impacto na migração de neutrófilos através da BHE em condições de TCE, bem como que o transporte transcelular poderá ser a via escolhida para o efluxo de neutrófilos para o cérebro, com a interação de moléculas de adesão (i.e., ICAM-1) e a produção de espécies reactivas de oxigénio.