The effect of innovative antimicrobial peptides in diabetic wound healing

Abstract

As úlceras de pé diabético (DFU) são umas das complicações mais severas e devastadoras da diabetes, constituindo uma das maiores despesas de saúde em todo o mundo. Esta condição representa um problema significativo de saúde pública, sendo uma das principais causas de amputações de membros inferiores. As úlceras de pé diabético que apresentam resultados clínicos pouco promissores, devem-se principalmente ao elevado risco de infeções microbianas que, juntamente com um processo de cicatrização comprometido, podem levar à necrose da ferida. Dada a natureza complexa da DFU crónica, a maioria dos tratamentos atuais não consegue proporcionar uma cicatrização adequada das feridas. Deste modo, torna-se crucial explorar alternativas de tratamento inovadoras e eficazes. Os péptidos antimicrobianos (AMPs) são moléculas efetoras que integram o sistema imune inato e que se encontram presentes em todos os organismos vivos. Contudo, em condições de diabetes, os seus níveis e/ou atividade encontram-se alteradas. Várias destas moléculas demonstraram notáveis propriedades antimicrobianas e imunomodeladoras de amplo espectro que contribuem para a reparação de tecidos, o que as torna potencias compostos terapêuticos para o tratamento de DFUs.Este estudo teve como principal foco um conjugado péptido-líquido iónico recentemente desenvolvido. Este péptido demonstrou um forte efeito antimicrobiano contra estirpes bacterianas e fúngicas, bem como a capacidade de estimular a produção de colagénio in vitro. Deste modo, o presente estudo teve como principal objetivo explorar o efeito deste péptido inovador no processo de cicatrização de feridas diabéticas. Para tal, avaliámos os seus potenciais efeitos citotóxicos (ensaio MTT) e impacto na migração celular (scratch assay) in vitro. Este estudo procurou também avaliar a capacidade in vivo do péptido-líquido iónico de modular a carga microbiana da ferida, as respostas inflamatórias e de promover a regeneração de tecidos em feridas de um modelo animal diabético. Para tal, foi conduzida uma experiência in vivo na qual se utilizou um modelo animal de ferida diabética. A diabetes tipo 1 foi induzida por injeções intraperitoneais de 50mg/kg de estreptozotocina durante cinco dias consecutivos. Após um período de seis semanas, duas incisões cutâneas foram induzidas no dorso de cada animal. O tamanho da ferida foi monitorizado diariamente através de marcação em acetato. A carga microbiana foi avaliada nos dias 0, 3, 7 e 10 da experiência. No dia 10, os animais foram anestesiados e sacrificados. Algumas amostras de pele foram recolhidas e posteriormente utilizadas para avaliar, através de análise imunohistoquímica, a presença de células inflamatórias, tais como macrófagos M1 (CD68, TNF-), macrófagos M2 (CD68, CD206) e linfócitos T (CD3), citocinas inflamatórias (IL-6 e MCP-1), bem como a angiogenese (CD31). Para além disso, foi realizado um ensaio de dihidroetídio para detectar e avaliar a produção de espécies reativas de oxigénio presentes nas criosecções cutâneas.Neste estudo verificámos que o conjugado péptido-líquido iónico não induziu toxicidade, em cultura celular de queratinócitos, nas quantidades utilizadas nos estudos in vivo. Contudo, não teve a capacidade de promover a migração de queratinócitos in vitro. Em contrapartida, o péptido possui propriedades consideráveis no contexto de cicatrização de feridas diabéticas in vivo. Os resultados obtidos indicaram que a aplicação de tratamentos com AMP promoveu significativamente o fecho da ferida em modelos animais diabéticos. Este péptido mostrou diminuir significativamente a carga microbiana presente no local da ferida, exibindo efeitos antimicrobianos pronunciados nos dias 3 e 7 do processo de cicatrização da ferida. Para além disso, os tratamentos tópicos com AMP resultaram na redução significativa da relação M1/M2 e dos linfócitos T, bem como da expressão de citocinas inflamatórias IL-6 e MCP-1, promovendo consequentemente uma diminuição do microambiente inflamatório. Os tratamentos com AMP demonstraram inclusivamente diminuir os níveis de ROS e promover a angiogenese no local da ferida. Verificou-se ainda que estes tratamentos foram capazes de melhorar a maturação da ferida, diminuindo a infiltração de células inflamatórias, aumentando a deposição de colagénio e melhorando a remodelação cutânea. Posto isto, os resultados obtidos demonstraram que a aplicação tópica de AMP promove a cicatrização da ferida, diminuindo a carga microbiana no local da ferida, o que por sua vez pode levar à diminuição da inflamação e do stress oxidativo, promovendo um ambiente mais regenerativo com aumento de angiogenese, o que resulta numa melhor maturação da ferida. Estes resultados sugerem que a aplicação deste AMP é bastante promissora no tratamento de úlceras de pé diabético.

Non-healing diabetic foot ulcers (DFUs) are one of the most serious and devastating complications of diabetes and one of the most expensive healthcare expenditures worldwide. This condition poses a significant public health concern as it is one of the leading causes of lower limb amputations. DFUs with poor clinical outcomes, mainly due to the elevated risk of multi-kingdom microbial infections which, along with an impaired wound healing process, can lead to wound necrosis. Given the complex nature of chronic DFU, most of the current treatments fail to provide proper wound healing. Therefore, it is crucial to explore innovative and effective treatment alternatives. AMPs are naturally occurring effector molecules of the innate immune system present in all living organisms. However, under diabetic conditions, the level and/or activity of these molecules is reduced. Several of these molecules have demonstrated remarkable broad-spectrum antimicrobial and immunomodulating properties, that contribute to tissue repair, making them promising candidates as therapeutic compounds for the treatment of DFUs.The research conducted in this study focused on a recently developed ionic-liquid antimicrobial peptide conjugate. This construct has demonstrated a robust antimicrobial effect, against both bacterial and fungal strains, as well as the capacity to stimulate collagen production in vitro. Therefore, the present study aimed to elucidate the effect of this innovative peptide in the diabetic wound healing. For this purpose, we examined the in vitro potential cytotoxic effects (MTT assay), and impact on cell migration (scratch assay). This study also explored the in vivo capacity of the ionic-liquid antimicrobial peptide to modulate the wound microbial load, the inflammatory responses, and promote tissue regeneration in wound healing in diabetic animal models. To achieve this, an in vivo experiment was conducted using a wound healing diabetic animal model. Type 1 diabetes was induced by intraperitoneal injections of 50 mg/kg streptozotocin for five consecutive days. The animals were kept diabetic for 6 weeks prior to the wounding. Next, two full-thickness skin incisions were inducted on the mice's dorsum. The wound size was daily monitored by acetate tracing. The cutaneous microbial load was assessed on days 0, 3, 7, and 10 of the experiment. On day 10, mice were anaesthetized and sacrificed. Skin samples were harvested and later used to evaluate, through an immunohistochemical analysis, the presence of inflammatory cells, particularly M1(CD68, TNF-), M2 macrophages (CD68, CD206) and T lymphocytes (CD3), inflammatory cytokines (IL-6 and MCP-1), as well as angiogenesis (CD31). Additionally, a dihydroethidium assay was performed to detect and measure the production of reactive oxygen species in skin cryosections.We found that peptide-ionic liquid conjugate did not induce toxicity in keratinocyte cell culture in the quantity used for the in vivo studies. However, the peptide was not able to promote migration in keratinocytes in vitro. In contrast, the peptide has remarkable properties in the context of in vivo diabetic wound healing. Our findings have indicated that the application of AMP treatments significantly promoted wound closure in diabetic animal models. This peptide showed to decrease significantly the microbial load at the wound site, exhibiting pronounced antimicrobial effects on days 3 and 7 of the wound healing process. Moreover, topical AMP treatments resulted in a significant reduction in M1/M2 ratio and T lymphocytes, as well as in the expression of IL-6 and MCP-I pro-inflammatory cytokines, consequently promoting a decrease in the inflammatory microenvironment. In addition, the treatment with AMP showed to decrease ROS levels and promote angiogenesis at the wound site. Furthermore, AMP treatments were able to improve wound maturation with a decrease in the infiltration of inflammatory cells, an increase in collagen deposition and improved skin remodeling.Altogether, the results showed that the topical application of the AMP promotes wound healing by decreasing the microbial load at the wound site, which in turn can lead to a decrease in inflammation and oxidative stress, promoting a more regenerative environment with an increase in angiogenesis, which then results in an enhanced wound maturation. These findings suggest that the application of this AMP holds promise in the treatment of diabetic foot ulcers.