Characterisation of Natural Killer T cell phenotype and function in alfa-Galactosidase A Deficiency

Abstract

A doença de Fabry é uma doença lisossomal de sobrecarga, ligada ao cromossoma X, causada pela deficiência da enzima alfa-Galactosidase A (α-Gal A), que leva à acumulação do lípido globotriosilceramida (Gb3). A apresentação clínica da doença de Fabry é altamente heterogénea e está relacionada com a atividade da α-Gal A, sendo que os casos mais graves não apresentam atividade da enzima. Ainda não é possível prever a progressão da gravidade da doença e identificar quais os doentes que devem ser tratados e quando deve ser iniciado o tratamento. Foi demonstrado que o modelo de ratinho da doença de Fabry tem uma frequência reduzida de um tipo específico de células T, as células T Natural Killer invariantes (iNKT). Ao contrário das células T convencionais, as células iNKT são células T restritas a CD1d, com um TCR semi-invariante, que reconhece lípidos e produzem rapidamente citocinas quando estimuladas. O Gb3, entre outros lípidos, pode impedir a ativação das células iNKT. Em humanos, em estudos anteriores não foram observadas alterações na percentagem de células iNKT em doentes com doença de Fabry atípica (início tardio) e com a variante cardíaca, apesar de haver variação no subset de células iNKT CD4+. Apenas foram analisadas as células iNKT dos doentes de início tardio e existe heterogeneidade nesta doença. Para além disso, pouco se sabe sobre o fenótipo das células iNKT nestes doentes. Assim, este estudo teve como objetivos o estabelecimento das condições experimentais, incluindo a definição dos marcadores e diversos painéis de citometria de fluxo para analisar o fenótipo e a função das células iNKT em doentes com doença de Fabry e caraterizar a frequência e o fenótipo das células iNKT nestes doentes, especialmente nos doentes com a apresentação clássica da doença (início precoce). A primeira tarefa consistiu em construir um painel de citometria de fluxo e definir/ otimizar as condições experimentais necessárias. As células iNKT foram identificadas utilizando anti-CD3 e um tetrâmero CD1d ligado a lípidos. O fenótipo celular foi estudado utilizando anti-CD4, anti-CD8α e anti-CD8β, bem como marcadores de ativação (ICOS) e exaustão (PD-1 e TIM-3). Foram feitas titulações para cada anticorpo/reagente. Tentámos identificar uma subpopulação de células iNKT citotóxicas circulantes, recentemente descrita na literatura. Surpreendentemente, os resultados não foram reprodutíveis, uma vez que a população circulante não foi obtida, pondo em causa a existência desta população.Após a das condições experimentais, foram analisadas células iNKT de quatro controlos saudáveis e de três doentes com doença de Fabry. Dois dos doentes apresentavam a variante clássica da doença, enquanto o terceiro doente apresentava a variante cardíaca de início tardio. Foi analisada a frequência de diferentes populações de leucócitos, subsets de células iNKT e o fenótipo das células iNKT de doentes com doença de Fabry, incluindo a expressão dos dímeros CD8, CD8αα e CD8αβ, nas células iNKT. As análises foram sempre comparadas com as células T convencionais (CD3+). Nos doentes observou-se uma tendência para uma maior percentagem de monócitos em relação aos indivíduos saudáveis, embora não fosse estatisticamente significativa. Esta alteração está de acordo com a literatura. Surpreendentemente, não foram observadas variações entre doentes e controlos no que diz respeito às percentagens de células B e T. No entanto, foram observadas diferenças na percentagem de leucócitos entre o doente Fabry em tratamento e os não tratados. Tal como esperado, a frequência de células iNKT não apresentou variação estatística entre os dois grupos de indivíduos. Embora não tenham sido observadas diferenças estatisticamente significativas entre os subsets CD4/CD8 iNKT dos controlos e dos doentes, os doentes Fabry apresentavam uma tendência para a redução do subset CD8+ iNKT, assim como para o aumento do subset DN iNKT. Os dadores saudáveis e os doentes Fabry não apresentaram qualquer variação relativamente aos dímeros CD8 das células iNKT. No entanto, foi observado que, em ambos os grupos, mais de 90% das células iNKT expressam CD8αα, enquanto mais de 82% das células CD3+ expressam CD8αβ. Não há muita informação disponível sobre a expressão destes dímeros nas células iNKT, embora a expressão mais elevada de CD8αα nas células iNKT também tenha sido obtida em quatro indivíduos saudáveis num estudo anterior. Relativamente ao fenótipo das células iNKT, os doentes Fabry apresentaram uma tendência para expressar mais PD-1 (63,8 ± 17,2 %) em comparação com os controlos (41,2 ± 24,6 %), mas esta diferença não foi estatisticamente significativa. Esta tendência também foi observada na expressão de ICOS, apesar de não ser estatisticamente significativa. A expressão de CD161 e TIM-3 nas células iNKT não apresentou diferenças entre os controlos e os doentes Fabry. No geral, não foram observadas diferenças significativas entre os doentes Fabry com diferentes fenótipos da doença. Com es

Fabry disease is a X-linked lysosomal storage disease caused by deficiency of the enzyme alpha-Galactosidase A (α-Gal A) which leads to the accumulation of the lipid globotriosylceramide (Gb3). The clinical outcome of Fabry disease is highly heterogeneous and it is related to the α-Gal A activity, with more severe cases presenting no activity. An unmet need for this condition is to predict progression of disease severity and to identify which patients should be treated and when treatment should start. It was demonstrated that the mouse model of Fabry disease has a reduced frequency of a specific type of T cells, the invariant Natural Killer T (iNKT) cells. Contrary to conventional T cells, iNKT are CD1d-restricted T cells, with a semi-invariant TCR, that recognise lipids and rapidly produce cytokines when stimulated. Gb3, among other lipids, can prevent iNKT cell activation. In humans, previous studies have found no alterations in iNKT cell percentage in patients with late onset Fabry disease patients with the cardiac variant, despite alteration in the CD4+ iNKT cell subset. Only the late onset patients’ iNKT cells have been analysed in the past and there is heterogeneity of this disease. Furthermore, little is known about iNKT cell phenotype in these patients. Hence, the aims of this study were to set up experimental conditions, including the definition of the markers and diverse flow cytometry panels to analyse the phenotype and function of iNKT cells in Fabry disease patients and to characterize iNKT cell frequency and phenotype in these patients, especially patients with the classical disease presentation. The first task was to construct a flow cytometry panel and define/optimise the required experimental conditions. iNKT cells were identified using anti-CD3 and a lipid loaded CD1d tetramer. Cell phenotype was unravelled by using anti-CD4, anti-CD8α and anti-CD8β as well as activation (ICOS) and exhaustion (PD-1 and TIM-3) markers. Titrations were done for each antibody/reagent. We attempted to identify a circulating cytotoxic iNKT cell subpopulation, recently described in the literature. Surprisingly, the results weren’t reproducible as the circulating population was not obtained, questioning the existence of this population.After validation of the experimental set up, iNKT cells from four healthy controls and three Fabry disease patients were studied. Two of the patients presented the classical variant of the disease whereas the other presented the late onset cardiac variant. The frequency of different leukocyte populations, iNKT cell subsets and iNKT cell phenotype of Fabry disease patients were analysed, including the expression of CD8 dimers CD8αα and CD8αβ in iNKT cells. The analyses were always compared to conventional T cells (CD3+). Patients presented a tendency to have a higher percentage of monocytes compared to healthy subjects, although not statistically significant. This alteration is in accordance with the literature. Surprisingly, no variations were observed between patients and controls regarding B cell and T cell percentages. On the other hand, differences regarding the leukocyte percentage were observed between the treated Fabry disease patient and non-treated patients. As expected, iNKT cell frequency showed no statistical variation between the two groups. Although no statistically significant differences were observed between controls and patients’ CD4/CD8 iNKT subsets, a reduction in the Fabry disease patients’ CD8+ iNKT subset, as well as a bias towards the increase of DN iNKT subset were observed. Healthy donors and Fabry disease patients presented no variation regarding iNKT cells CD8 dimers. However, it was observed that in both groups more than 90% of iNKT cells express CD8αα whereas more than 82% of CD3+ cells express CD8αβ. Little is known about the expression of these dimers in iNKT cells, albeit the higher expression of CD8αα in iNKT cells was also obtained in in four healthy subjects from a previous study. Regarding iNKT cell phenotype, Fabry disease patients’ iNKT cells presented a tendency to express more PD-1 (63.8 ± 17.2 %) compared to controls (41.2 ± 24.6 %) but it wasn’t statistically significative. This tendency was also observed in ICOS expression, in spite of not being statistically significative. CD161 and TIM-3 expression in iNKT cells presented no differences between controls and Fabry disease patients. Overall, no significant differences were observed among the Fabry disease patients presenting different disease phenotypes. With this study, the necessary conditions to study iNKT cells were defined. Due to the low number of Fabry disease patients and healthy controls analysed, it is still early to conclude about differences in leukocyte percentage, including iNKT cells, and iNKT cell phenotype in Fabry disease patients.