Role of GluN2B-containing NMDARs on network activity and synapse maturation through the interaction with EphA4

Abstract

Synapses are critical for neuronal communication and cognitive functions. Santiago Ramón y Cajal's work laid the foundation for understanding synapse structure. Dendritic spines that harbor these synapses exhibit high plasticity, and come in different types, with each one serving various functions in synaptic plasticity, vital for learning and memory. Receptors at these sites such as NMDA and AMPA receptors and their subunits take part in synaptic plasticity, along with shaping neuronal circuits, and their disruption entails the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer’s disease (AD) and autism spectrum disorder (ASD). EphA4 also plays a vital role in regulating dendritic spines, affecting network activity, spine structure, and the movement of AMPARs within synapses. Past research suggests decreased EphA4 levels in GluN2B knockout (KO) mice cortical neurons, though its precise function remains uncertain. We propose that EphA4 forms a signaling complex with NMDARs, specifically through the GluN2B subunit, potentially contributing to the effects on network activity and synapse development, in the absence of the GluN2B subunit. Our study seeks to achieve four main objectives: characterize spine structure and network activity in GluN2B KO cultures, analyze EphA4 expression and activity within these cultures, evaluate EphA4's effects on neuronal branching, and explore the interaction between EphA4 and NMDARs.Multi-electrode array analysis (MEA) revealed that cortical cultures from GluN2B KO cultures showed increased firing rates, bursts, and erratic bursting patterns compared to wild-type (WT) cultures, indicating altered network activity. Additionally, KO neurons exhibited more immature dendritic spines with a higher density of filopodia-like spines, while WT neurons had more mature, mushroom-like spines, revealing the preponderant role of GluN2B in spine maturation. EphA4 expression was found to be reduced in KO neurons, suggesting its involvement in spine maturation. Immunoprecipitation (IP) assays also disclose an interaction between EphA4 and GluN2B-containing NMDARs (GluN2B-NMDARs), possibly impacting spine development and network activity, which may be different with age.Overall, these findings deepen our knowledge of how GluN2B-NMDARs and EphA4 collaboratively impact network activity and synapse maturation, revealing a novel interaction mechanism with broad implications for synaptic processes.

As sinapses são críticas para a comunicação neuronal e funções cognitivas. O trabalho de Santiago Ramón y Cajal lançou as bases para a compreensão da sua estrutura. As espinhas dendríticas que abrigam essas sinapses exibem alta plasticidade e podendo ser classificadas em diferentes tipos, cada uma desempenhando diversas funções na plasticidade sináptica, vital para a aprendizagem e memória. Os recetores sinápticos, como os recetores NMDA e AMPA e as suas subunidades, participam na plasticidade sináptica, juntamente com a formação de circuitos neuronais, e a sua disfunção está associada ao aparecimento de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer (DA) e a perturbação do espetro do autismo (PEA). O recetor EphA4 também desempenha um papel vital na regulação das espinhas dendríticas, afetando a atividade da rede neuronal, a sua estrutura e o tráfego dos recetores AMPA nas sinapses. Trabalhos anteriores descreveram níveis reduzidos de EphA4 em neurónios corticais de murganho sem a subunidade GluN2B (KO), embora sua função precisa permaneça incerta. Neste estudo, propomos que o recetor EphA4 forma um complexo de sinalização com recetores NMDA, especificamente através da subunidade GluN2B, exercendo influência na atividade da rede neuronal e no desenvolvimento de sinapses. O nosso estudo divide-se em quatro objetivos principais: caracterizar a estrutura das espinhas dendríticas e a atividade da rede neuronal em culturas GluN2B KO; analisar a expressão e atividade de EphA4 nessas culturas; avaliar os efeitos do EphA4 na ramificação neuronal; e explorar a interação entre EphA4 e os recetores NMDA.Os nossos resultados revelam que culturas corticais de murganho de GluN2B KO mostram taxas de disparo e padrões de disparo erráticos e aumentados em comparação com as culturas selvagens (WT), indicando uma atividade da rede neuronal alterada. Além disso, os neurónios KO exibem espinhas dendríticas mais imaturas, enquanto os neurónios WT apresentam espinhas mais desenvolvidas, revelando o papel preponderante do GluN2B na maturação destas estruturas. Verificou-se que a expressão de EphA4 está reduzida nos neurónios KO, sugerindo seu envolvimento na maturação das espinhas dendríticas. Os ensaios de imunoprecipitação (IP) também expuseram uma interação entre EphA4 e recetores NMDA contendo GluN2B (GluN2B-NMDARs), sugerindo que este complexo está envolvido no desenvolvimento das espinhas dendríticas e na atividade da rede neuronal, sendo que este efeito pode potencialmente estar associado à idade.No geral, estas descobertas aprofundam o nosso conhecimento de como GluN2B-NMDARs e EphA4 impactam colaborativamente a atividade da rede neuronal e a maturação das sinapses, revelando um novo mecanismo de interação com amplas implicações para os processos sinápticos.