O PAPEL DOS LACTOBACILLUS NO FENÓTIPO INDUZIDO PELA SUPLEMENTAÇÃO DE AMINOÁCIDOS DE CADEIA RAMIFICADA EM COILITE ULCEROSA

Abstract

Inflammatory bowel disease (IBD) is a condition characterized by a chronic and pathological inflammatory state of the intestinal mucosa, which includes Chorn’s disease (CD) and Ulcerative Colitis (UC). Although the etiology of this disease is still poorly understood, genetic factors, host immune system and environmental factors, especially diet and intestinal microbiota composition, are described as major players in the progression of the disease. Previous results in the research group, using a metagenomic analysis, revealed a significant reduction of the species Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri e Lactobacillus taiwanensis in C57BL/6 mice after supplementation with branched-chain amino acids. This work aims to assess the role of these three species of Lactobacillus upon supplementation with branched-chain amino acids and characterize its effect within the epithelial barrier and immune response, along with understanding the effect of these species during inflammation, using murine models of UC. Afterwards, a prospective longitudinal observational study was performed using patient samples to allow the association between the level of these lactobacillus species in the intestine with the disease severity. To unravel how the supplementation in combination with these species could potentially have probiotic effects upon the development of IBD, we tested the supplementation upon dextran sulphate sodium (DSS)-induced colitis model. We observed that the supplemented mice, both males and females, presented a stronger epithelial barrier, offering an increased protection against inflammatory events in an acute model of colitis with recovery, compared with the control group. Contrary, when the supplementation was performed in a dysbiotic environment, after an inflammatory event, mice presented a more aggressive disease, suggesting that supplemented mice present different vulnerability depending on the colitis model used. On the other hand, when supplemented mice are submitted to an acute model without recovery, a reduced symptomatology of colitis in both sexes was observed being associated with a significant decreased level of TNF-alfa, IL-1beta, IL-6 e IL-17A, along with an increase in the levels of IL-22, even if not significant. Regarding goblet cells, we verify a protection in supplemented females, while in males this effect was not visible due to destruction of the epithelial barrier. The administration of branched-chain amino acids and the three species in females not only reduce weight loss, cellular infiltration and crypt destruction, but also promote the significant increase in goblet cell count, strengthening the hypothesis that the combination of these species has a beneficial effect upon inflammation. In parallel, preliminary results suggest a significant reduction of L. taiwanensis levels in stool of UC patients, while the levels of L. reuteri and L. johnsonii were undetectable in the same samples. In conclusion, our study demonstrates that supplementation with these three species of Lactobacillus unleashed a protective effect in DSS-induced colitis using mice and two different models, indicating that the combination of these species can be a potential probiotic agent to improve colitis and, in the future, an adjuvant to therapy to fight intestinal inflammation.

A doença inflamatória intestinal (DII) é caracterizada como uma patologia inflamatória crónica da mucosa intestinal, que abrange a Doença de Crohn (DC) e a Colite Ulcerosa (CU). Embora a etiologia desta doença ainda não esteja completamente definida, fatores genéticos, o sistema imunológico do hospedeiro e fatores ambientais, especialmente a dieta e a composição da microbiota intestinal, são descritas como contribuintes para a progressão da doença. Através de uma análise metagenómica, realizada em um estudo anterior, observamos que as espécies Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri e Lactobacillus taiwanensis estavam significativamente diminuídas em murganhos C57BL/6 após a suplementação com aminoácidos de cadeia ramificada. Este trabalho tem como objetivos avaliar o papel destas três espécies de Lactobacillus no contexto da suplementação com aminoácidos de cadeia ramificada e caracterizar o seu efeito na barreira epitelial e na resposta imunológica, bem como perceber qual o seu impacto durante a inflamação, utilizando modelos murinos de CU. Consecutivamente, foi realizado um estudo observacional longitudinal prospetivo através de uma coorte humana, que nos permitirá fazer uma associação entre os níveis de espécies de Lactobacillus no intestino e a gravidade da doença. Para desvendar como a suplementação da combinação destas espécies potencialmente probióticas afeta o desenvolvimento da DII, analisamos o efeito da sua suplementação em diferentes modelos de colite induzida por sulfato de sódio dextrano (DSS). Observamos que os animais suplementados, tanto machos como fêmeas, apresentam uma barreira epitelial mais robusta, conferindo-lhes uma maior proteção contra eventos inflamatórios num modelo agudo de colite com recuperação, comparados com o grupo controlo. Contrariamente, quando a suplementação é feita em um ambiente disbiótico, após um ciclo inflamatório de doença, os animais apresentam uma doença mais agressiva, o que sugere que os animais suplementados apresentam vulnerabilidades diferentes depende do modelo de colite utilizado. Por outro lado, quando os animais suplementados são submetidos a um modelo agudo sem recuperação, observamos uma diminuição sintomática da colite em ambos os sexos associados a níveis significativamente diminuídos de TNF-alfa, IL-1 beta, IL-6 e IL-17A, bem como um aumento de IL-22, apesar de este não ser significativo. Relativamente às células caliciformes verifica-se uma proteção nas fêmeas suplementadas, no entanto nos machos este efeito não é visível, devido à destruição do epitélio. Quando procedemos à administração de aminoácidos de cadeia ramificada em combinação com a suplementação bacteriana em fêmeas, descobrimos que estas bactérias não só reduzem a perda de peso, a infiltração celular e a destruição de criptas, como também se observou um aumento significativo do número de células caliciformes, fortalecendo a hipótese de que a combinação destas espécies pode conferir benefícios em contexto inflamatório. Em paralelo, os resultados preliminares sugerem uma diminuição significativa dos níveis de L. taiwanensis nas fezes de doentes com CU, enquanto os níveis de L. reuteri e L. johnsonii revelaram-se indetetáveis nas mesmas amostras. Em conclusão, o nosso estudo demonstra que a suplementação com estas três espécies de Lactobacillus exerceu um efeito protetor na colite induzida por DSS em murganhos em dois modelos diferentes de colite, indicando que a combinação destas espécies bacterianas poderá ser um potencial agente probiótico para melhorar a colite e, futuramente, um adjuvante da terapêutica para combater a inflamação intestinal.