SortingID: Identification of axonal proteins trafficked through dendritic endosomes

Abstract

Establishment and maintenance of neuronal polarity are critical for the development and function of the nervous system. Therefore, neurons have developed sophisticated mechanisms to control the distribution of proteins to their cellular processes. Currently, only the polarization of dendritic membrane proteins is well understood. Dendritic cargoes are sorted into specific populations of vesicles in the Golgi Apparatus and then trafficked directly to the dendrites. On the other hand, the polarization of axonal membrane proteins still remains under intense debate. Golgi-to-axon transport has been proposed as the major trafficking pathway for the polarization of axonal cargoes, but this mechanism has only been demonstrated for a reduced number of proteins. Conversely, a growing number of studies support that axonal membrane proteins may be either first trafficked to the dendritic membrane and then translocated into the axonal domain or equally transported to both compartments, but selectively removed from the dendrites. In addition, loss of dendritic endosome-associated proteins was shown to impair the polarization of numerous axonal proteins, indicating a relevant role for dendritic endosomes in axonal polarization. Therefore, I hypothesize that dendritic endosomes are key sorting stations that direct the polarization of axonal cargoes. To address this question, I sought to identify the axonal cargoes that are trafficked via dendritic endosomes by performing proximity-dependent labeling (PDL) in neuronal cultures. Firstly, I generated plasmids expressing dendritic endosomal markers fused to the biotin ligase TurboID. After assembling the constructs, their biotin ligase activity and pattern of compartmentalization was assessed by western blot and immunocytochemistry. I observed that the fusion proteins colocalized with dendritic endosomes and showed biotin ligase activity in cortical neurons, confirming that they could be used to perform PDL in neuronal cultures. Finally, PDL was performed in dense cultured cortical neurons and the axonal proteins present in dendritic endosomes were identified by streptavidin-mediated pulldown and mass spectrometry (MS). MS followed by protein enrichment analysis identified a total of 58 axonal cargoes that may be trafficked through dendritic endosomes, including 34 membrane proteins. The number of proteins identified suggests a previously underestimated role for dendritic endosomes regarding the polarization of axonal cargoes. Among the membrane proteins identified, three of them, APP, Neurexin-1 and the neural cell adhesion molecule L1, have already been shown to undergo dendritic endosome-mediated transcytosis. Moreover, other members belonging to the family of these proteins were identified in the proteome of dendritic endosomes, indicating that transport through dendritic endosomes might be a conserved trafficking mechanism is these protein families. Lastly, some axonal proteins identified, notably APP, ApoE, Tau and Neurexin family members, have been strongly implicated in neurological disorders. These observations highlight the importance of studying the role of dendritic endosomes in axonal polarization, as it may help elucidating the pathological mechanisms of disease and contribute to the design of new therapies. In summary, I have developed new tools for proteomic analysis through PDL, which allowed me to uncover the axonal proteins that are present in dendritic endosomes, and are likely undergoing sorting in this subcellular compartment. This enhances our comprehension about the role of dendritic endosomes in axonal polarization, but also helps to uncover the trafficking pathways responsible for the polarization of axonal cargoes. Moreover, elucidating these trafficking pathways will be of uttermost importance to understand the mechanisms underlying the maintenance of neuronal polarity and normal brain function.

O estabelecimento e a manutenção da polaridade neuronal são fundamentais para o desenvolvimento e função do sistema nervoso. Deste modo, os neurónios desenvolveram mecanismos sofisticados para controlar a distribuição de proteínas para os seus processos neuronais. Atualmente, apenas a polarização das proteínas membranares dendríticas é bem compreendida. As proteínas dendríticas são incorporadas em vesículas específicas no complexo de Golgi e depois são transportadas diretamente para as dendrites. Por outro lado, a polarização das proteínas membranares axonais continua a ser objeto de intensa investigação. O transporte direto do complexo de Golgi para o axónio tem sido proposto como a principal via de transporte que leva à polarização de proteínas axonais, mas este mecanismo apenas foi demonstrado para um número reduzido de proteínas. Por outro lado, um número crescente de estudos apoia a ideia de que as proteínas da membrana axonal são primeiro transportadas para a membrana dendrítica e só depois transcoladas para o axónio, ou igualmente transportadas para ambos os compartimentos, mas seletivamente removidas das dendrites. Para além disso, foi demonstrado que a deleção de proteínas associadas aos endossomas dendríticos contribui para a perda de polarização de numerosas proteínas axonais, indicando que os endossomas dendríticos poderão ter um papel mais relevante para a polarização axonal do que o que se julgava anteriormente. Tendo isto em conta, eu defini como hipótese para este estudo que os endossomas dendríticos são reguladores fundamentais da polarização de proteínas axonais. Para responder a esta questão, eu procurei identificar as proteínas axonais que são transportadas por dos endossomas dendríticos através de marcação dependente da proximidade (PDL) em culturas neuronais. Para isso, comecei por gerar plasmídeos que expressam marcadores de endossomas dendríticos fundidos com a ligase de biotina TurboID. Após a preparação das construções, a sua atividade de ligase de biotina e o padrão de compartimentação foram avaliados por western blot e imunocitoquímica. Eu observei que as proteínas de fusão colocalizavam com endossomas dendríticos endógenos e apresentavam atividade de ligase de biotina em neurónios corticais, confirmando que podiam ser utilizadas para realizar PDL em culturas neuronais. Por último, eu realizei PDL em culturas densas de neurónios corticais e as proteínas axonais presentes nos endossomas dendríticos foram identificadas por espetrometria de massa (MS). Análise do enriquecimento de proteínas dos resultados de MS levou à identificação de um total de 58 proteínas axonais que podem ser transportadas através de endossomas dendríticos, incluindo 34 proteínas membranares. O número de proteínas identificadas sugere um papel previamente subestimado dos endossomas dendríticos no que respeita à polarização de proteínas axonais. Entre as proteínas membranares identificadas, três delas, APP, Neurexina-1 e a molécula de adesão celular neural L1, são conhecidas por sofrer transcitose mediada por endossomas dendríticos. Além disso, outros membros pertencentes à família destas proteínas foram identificados no proteoma dos endossomas dendríticos, indicando que o transporte mediado por endossomas dendríticos pode ser um mecanismo de transporte conservado nestas famílias de proteínas. Por último, algumas das proteínas axonais identificadas, nomeadamente APP, ApoE, Tau e a família das Neurexinas, já foram implicadas em várias doenças neurológicas. Estas observações realçam a importância do estudo do papel dos endossomas dendríticos na polarização axonal, uma vez que pode ajudar a elucidar os mecanismos patológicos das doenças e contribuir para a conceção de novas terapias. Em resumo, eu desenvolvi novas ferramentas para a análise de proteomas através da PDL, o que me permitiu descobrir as proteínas axonais que estão presentes nos endossomas dendríticos e que, provavelmente, são transportadas por estes compartimentos subcelulares. Este trabalho vai contribuir para o aumento da nossa compreensão sobre o papel dos endossomas dendríticos na polarização axonal, mas também ajuda a descobrir as vias de tráfico responsáveis pela polarização das proteínas axonais. Para além disso, a elucidação destas vias de tráfico será de extrema importância para compreender os mecanismos responsáveis pela manutenção da polaridade neuronal e pelo normal funcionamento do cérebro.