Using a high-throughput genetic screen to identify Plasmodium molecules that interact with the host’s innate immune system

Abstract

A malária é uma doença infeciosa transmitida por mosquitos e causada por parasitas do género Plasmodium, que continua a ser uma das principais preocupações em termos de saúde por ser uma causa significativa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo. Apesar de inúmeros esforços, o desenvolvimento de vacinas e de intervenções terapêuticas eficazes tem sido dificultado pela falta de conhecimentos sobre as respostas imunitárias induzidas pelo parasita no hospedeiro vertebrado. Devido à sua natureza assintomática, durante muitos anos assumiu-se que a fase hepática da infeção por Plasmodium não contribui para o estabelecimento da patologia. No entanto, o parasita desencadeia uma resposta inata de interferão (IFN) tipo 1 no fígado para controlar a carga parasitária. Ao longo do tempo, os parasitas da malária desenvolveram uma maquinaria refinada para modular a resposta imunitária do hospedeiro, no entanto, as funções dos genes do parasita envolvidos no desenvolvimento da fase hepática permanecem mal caracterizadas.Esta tese tem como objetivo identificar moléculas de Plasmodium que interagem com o sistema imunitário inato do hospedeiro e contribuem para o resultado da fase hepática da infeção. Para tal, utilizámos uma ferramenta de rastreio genético de alto rendimento baseada em pools de mutantes knockout (KO) de P. berghei em ratinhos imunocompetentes e imunodeficientes. Demonstrámos, através do acompanhamento do desenvolvimento dos parasitas ao longo do seu ciclo de vida, que o sangue congelado infetado com parasitas KO pode ser mantido e enviado para toda a Europa, e validámos a reprodutibilidade da nossa metodologia proposta, mostrando que o conjunto de parasitas, bem como a sua frequência e abundância, em cada fase do ciclo de vida, é semelhante entre dois replicados técnicos. Em seguida, analisámos 192 genes de Plasmodium em ratinhos C57BL/6J e Ifnar1-/-, nos quais a resposta de IFN de tipo I é abolida, para revelar possíveis proteínas que estão diretamente envolvidas na evasão e/ou na modulação da resposta IFN de tipo I no fígado por parte do parasita. Os dados revelaram que 21 destes genes são provavelmente essenciais para o crescimento do parasita no fígado, independentemente do estado imunitário do hospedeiro. Uma análise mais aprofundada revelou que 3 genes foram necessários para o crescimento na presença de um sistema imunitário intacto, enquanto não foram necessários para o crescimento em ratinhos imunodeficientes. Dos 79 parasitas KO presentes no sangue de ambos os modelos de ratinho, destacámos 7 pelo seu perfil de desenvolvimento diferente entre ratinhos WT e Ifnar1-/-, relativamente à sua capacidade de sobrevivência e capacidade de replicação em cada grupo de ratinhos. Apesar destas evidências, a nossa revisão literária não identificou uma ligação clara entre os genes identificados e a resposta de IFN tipo 1 durante a fase hepática da infeção.Esta tese valida a utilização da abordagem de sequenciação NGS baseada em códigos de barras para estudar os efeitos do sistema imunitário do hospedeiro no desenvolvimento do parasita, permitindo a identificação de diferentes parasitas KO que respondem de forma diferente a diferentes pressões imunitárias. Além disso, revela que certos genes do parasita podem ser necessários para contrariar as respostas imunitárias do hospedeiro no fígado.

Malaria is a mosquito-borne infectious disease caused by Plasmodium parasites that remains a major health concern as a significant cause of morbidity and mortality worldwide. Despite numerous efforts, the development of effective vaccines as well as therapeutic measures has been challenged by the scarcity of knowledge on the immune responses elicited on the vertebrate host by the parasite. Due to its asymptomatic nature, for many years it was assumed that the liver stage of infection does not contribute to the establishment of pathology. Nevertheless, Plasmodium triggers an innate type 1 IFN response in the liver to control parasite load. Malaria parasites have evolved a machinery to modulate the host’s immune response. However, the specific functions of parasite genes during their liver stage development remain poorly characterized.This thesis aims to identify Plasmodium molecules that interact with the host’s innate immune system and contribute to the outcome of the liver stage of Plasmodium infection. To this end, we used a high-throughput genetic screening tool based on the infection of immunocompetent and immunodeficient mice by pools of P. berghei knockout (KO) mutants. We demonstrated, following the development of the parasites throughout its life cycle, that frozen blood infected with KO parasites can be maintained and shipped across Europe, and we validated the reproducibility of our proposed methodology by showing that the pool of parasites, as well as their frequency and abundance, at each stage of the life cycle, is similar between two replicates. Next, we screened 192 Plasmodium genes in C57BL/6J and Ifnar1-/- mice, in which type I IFN response is ablated, to identify possible proteins that are directly involved in parasite evasion and/or modulation of the type I IFN response in the liver. The data revealed that 21 of these genes were likely essential for parasite growth in the liver, regardless of the host’s immune status. Further analysis revealed that 3 genes were required for growth in the presence of an intact immune system, which were not required for growth in immunodeficient mice. From the 79 KO parasites present in the blood of both mouse models we highlighted 7 for their different developmental profile between WT and Ifnar1-/- mice, based on their ability to survive and capacity to replicate in each group of mice. Despite these evidences, our literature review did not identify a link between the genes identified and the type 1 IFN response during the liver stage infection.This thesis validates the use of the barcode-based NGS sequencing approach to study the effects of the host immune system on parasite development, enabling the identification of different KO parasites that respond differently to different immune pressures. Moreover, it reveals that certain parasite genes may be required to counter host immune responses in the liver.