The immunomodulatory effect of the roots of Withania Somnifera encapsulated into β-glucan particles

Abstract

Withania Somnifera, também conhecida como Ashwagandha, tem tido um lugarproeminente na medicina Ayurveda, o sistema de medicina tradicional indiano. Deste modo,ao longo dos anos, a utilização das raízes de W. somnifera tem ganho interesse devido àdiversidade de constituintes químicos com potenciais terapêuticos. Incluem propriedadescomo anti-inflamatório, imunomodulador, anticancerígeno, neuroprotetor, anti-stress eantioxidante. Dado que o perfil de toxicidade de WS está bem estabelecido, é consideradoum agente medicinal seguro. No entanto, o mecanismo molecular subjacente ao seu efeitoanti-inflamatório é pouco compreendido. O uso de sistemas de entrega de compostos compropriedades terapêuticas, permitindo uma libertação controlada, tem sido explorado comvista a otimizar as propriedades dos compostos. Neste projeto foi estudado o uso departículas de β-glucano (GPs) como veículo de entrega de compostos da W. somnifera. Oβ-glucano é um grupo de polissacarídeos de β-D-glicose encontrados na parede celular demuitos organismos, incluindo leveduras, fungos, plantas e bactérias. Tem sido demonstradoinduzir uma ampla gama de funções, sendo considerado um potente ativador do sistemaimunológico inato. Isso é alcançado por meio da fagocitose e processamento de GPs porcélulas do sistema imunitário, levando à ativação de granulócitos, monócitos, macrófagos ecélulas natural killer. Como resultado, as GPs têm ganho grande importância como sistemasde entrega de medicamentos e de antigénios tendo o papel de adjuvantes de vacinas.Neste estudo, o objetivo foi avaliar o efeito imunomodulador de W. Somnifera,encapsulada em partículas de glucano, recorrendo a estudos in vitro. Os compostosencapsulados resultam da extração com etanol das raízes de Withania Somnifera, combinadacom partículas de β-glucano preparadas a partir do tratamento alcalino/ácido de Saccharomycescerevisiae. O estudo visa avaliar o efeito imunomodulador de W. somnifera em estudos in vitro,tentando esclarecer como o uso de GPs pode potencializar os efeitos dos componentes ativosde W. Somnifera. Por isso, espécies reativas de oxigênio (ROS), produção de óxido nítrico(NO) e viabilidade celular foram avaliadas na linhagem de células de macrófagos murinos, RAW264.7. Foram realizados ensaios de proliferação em células mononucleares do sangueperiférico (PBMCs) após 96 h de incubação. Além disso, os níveis de ROS foram avaliados emneutrófilos humanos. A quantificação de citocinas foi realizada por ELISA em células do baçode camundongos CD-1, sobrenadante de células RAW 264.7 e neutrófilos humanos.GPs não carregadas e carregadas com WS demonstraram um aumento na produçãode ROS em células RAW 264.7, ao contrário dos extratos de WS, que demonstraram inibiçãode maneira dependente da concentração. Além disso, observou-se um aumento nos níveis deXIVTNF-α e IL-6 nas células RAW 264.7 com o uso de GPs, isto é, quer as GPs não encapsuladasquer as encapsuladas com WS. A produção de TNF-α também foi observada em células dobaço, sem produção de citocinas com o uso apenas de extratos de WS. Não houve produçãode IL-10, Il-12 ou TNF-α em neutrófilos humanos. Todas as concentrações testadasapresentaram uma percentagem de viabilidade celular acima de 70%, em comparação comcélulas não estimuladas. Além disso, quando as GPs estão presentes, estas mostram efeitoscontrários quando do uso apenas de WS. Adicionalmente, quando comparado GPs nãoencapsuladas com GPs encaspuladas com WS, pode existir algumas discrepâncias nosresultados pois os componentes de WS podem ser responsáveis por alterar as propriedadesdas GPs.Os resultados desses estudos destacam as propriedades anti-inflamatórias de WS.Embora as GPs tenham demonstrado um efeito pró-inflamatório, as GPs carregadas com WSefetivamente mitigaram a resposta induzida pelas GPs vazias. No entanto, é importante realçarque as GPs demonstraram um efeito sinergístico na citotoxicidade dos componentes ativosde WS. Para obter insights mais profundos, são necessários ensaios abrangentes adicionaispara desvendar as correlações subjacentes.

Withania Somnifera, commonly known as Ashwagandha, holds a prominent place inAyurvedic medicine, the ancient Indian medical system. The utilization of W. somnifera rootsis gaining momentum due to their diverse array of chemical constituents that offer therapeuticvalue. These include compounds with properties such as anti-inflammatory,immunomodulatory, anti-cancer, neuroprotective, anti-stress, and antioxidant properties.Given that WS's toxicity profile is well-documented, it is considered a safe medicinal agent.Nevertheless, the molecular mechanism of action underlying its anti-inflammatory effect ispoorly understood. In this work, the encapsulation of the WS compounds into β-glucanparticles (GPs) was explored to obtain WS formulations with additional properties. Theβ-glucan is a group of β-D-glucose polysaccharides found in the cell walls of many organismsincluding yeast, fungi, plants, and bacteria. β-glucan has been shown to have a broad range ofproperties, in particular, it is known to be a potent activator of the innate immune system.This is achieved through the phagocytosis and processing of GPs by cells of the immunesystem, leading to the activation of cells like granulocytes, monocytes, macrophages, andnatural killer cells. As a result, GPs have gathered significance as drug delivery system andadjuvant, particularly in the context of vaccination.This way, the aim of this project was to evaluate the immunomodulatory effect of theW. somnifera loaded into glucan particles through in vitro studies. The ethanol extract from theroots of Withania Somnifera was encapsulated into β-glucan particles prepared fromalkaline/acid treatment of Saccharomyces cerevisiae. Therefore, reactive Oxygen Species (ROS)production, Nitric Oxide (NO) production, and cell viability were evaluated on the murinemacrophage cell line, RAW 264.7. Proliferation assays were determined on PBMCs after 96 hof incubation. ROS was also evaluated on human neutrophils. Cytokine quantification wasperformed by ELISA on the supernatants of the CD-1 mice spleen cells, RAW 264.7 and humanneutrophils.Unloaded and WS-loaded GPs showed an increase in ROS production on RAW 264.7cells, contrary to the WS extracts that showed to inhibit it in a concentration-dependentmanner. Besides, it was observed an increase of TNF-α and IL-6 levels on RAW 264.7 withthe use of both, unloaded and WS-loaded GPs. The production of TNF-α was also observedin spleen cells, with no production of any cytokine with the use of WS extracts only. There´sno production of IL-10, IL-12, or TNF-α on human neutrophils. All the tested concentrationsshowed a cell viability percentage above 70%, compared with unstimulated cells. Furthermore,when GPs are present, they exhibit contrasting effects compared to the WS components.XIIAdditionally, when comparing unloaded and loaded GPs, discrepancies in the results can beobserved, as the WS components are occasionally responsible for altering the properties ofthe GPs.The findings from these studies underscore the anti-inflammatory properties of WS.While GPs demonstrated a pro-inflammatory effect, WS-loaded GPs effectively mitigated theresponse induced by empty GPs. Nevertheless, it's important to highlight that GPsdemonstrated a synergistic impact on the cytotoxicity of the active components in WS. Togain deeper insights, further comprehensive assays are warranted to unravel the underlyingcorrelations.