Exploring The Immunomodulatory Potential of Toll-like Receptor Agonists Encapsulated within Glucan Particles as Vaccine Adjuvants

Abstract

Toll-like receptors (TLRs) are vital pattern recognition receptors that identify invading pathogens. CL097, a dual TLR7/8 agonist, and Poly (I:C), a TLR3 agonist, possess established immunomodulatory attributes. Additionally, β-glucan, which activates immune cells through TLR2/6, dectin-1, and CR3 receptors, also displays immunomodulatory potential. Notably, glucan particles (GPs) extracted from baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) exhibit similar characteristics and serve as a promising drug delivery system, proficiently encapsulating various compounds to harness their immunomodulatory capacities. Taking these characteristics into consideration, this thesis aims to generate β-glucan particles (GPs) from baker's yeast, encapsulating CL097, Poly (I:C), and a SARS-CoV-2 spike protein. With these formulations, we expect to assess whether these combinations can elicit an immune response and function as vaccine adjuvants in various settings: in vitro studies using murine cells, human neutrophils, and PBMCs; as well as an in vivo study with mice.GPs were obtained by a series of alkaline and acidic extractions and CL097 and Poly (I:C) were encapsulated through osmotic gradient, using different GPs:CL097 and GPs:Poly (I:C) ratios to find optimal encapsulation. Particle size and zeta potential were measured by Dynamic Light Scattering (DLS) and Electrophoretic Light Scattering (ELS), respectively. Reactive oxygen species (ROS) production, nitric oxide (NO) production and cell viability (MTT assay) were evaluated in the murine macrophage cell line, RAW 264.7. The ROS production was also evaluated in neutrophils isolated from human buffy coat. Additionally, cytokine quantification was performed by ELISA in C57BL/6 mice spleen cells’ supernatant, RAW 264.7 and human neutrophils. A SARS-CoV-2 antigen was incorporated into the GPs-CL097 and the formulation was evaluated in immunization studies with C57BL/6 mice as an oral vaccine. Mice were first immunized subcutaneously, follow by oral immunizations every two weeks (3 in total). Faeces and blood samples were collected before each immunization and at the end of the experiment. Additionally, nasal and vaginal washings were also collected on the last day to evaluate mucosal antibody production, while spleen cells and the liver harvested for cytokine quantification.After the extraction process, GPs presented a size of approximately 5.3 ± 0.6 μm and neutral surface charge, 2.9 ± 0.4 mV. With respect to ROS production, both empty and CL097- and Poly (I:C)-loaded GPs revealed a concentration-dependent response and a synergistic effect for the lower concentrations. Regarding NO production, CL097 induce a more prominent response alone, even though GPs-Poly (I:C) promoted greater responses. It was observed a production of TNF-α and IL-6 induced by the CL097 in both spleen cells and RAW 264.7, while GPs were only able to induce TNF-α. The Poly (I:C), on the other hand was able to induce a response in RAW 264.7, demonstrating a synergistic effect with GPs in the TNF-α production, while being the only one responsible for the IL-6 production. GPs were able to promote cell proliferation in PBMCs after 24 h incubation. Additionally, CL097 alone was able to generate an oxidative burst in neutrophils, but was incapable of inducing cytokine production as were GPs and Poly (I:C). All tested concentrations maintained cell viability percentages above 70 % relative to unstimulated cells. For the in vivo studies we observe a balanced Th1/Th2 immune response when evaluating IgG and IgG isotypes production in serum of the vaccinated mice. With respect to sIgA production, our vaccine formulation was able to induce a mucosal immune response in nasal mucosa (1/5) and in almost all animals in the gastrointestinal mucosa (4/5). It also generated a Th1 and Th17 immune response with the release of IFN-γ and IL-17 in spleen cells and IFN-γ in the liver tissue interstitial fluid.In conclusion, the GP + TLR agonist + antigen oral vaccine formulation is a pivotal advance for strong immune responses against SARS-CoV-2. It offers potent immune activation, broad cellular and humoral immune response, and harnesses GP-TLR synergy, providing a foundation for current and future epidemics caused by viruses.

Recetores Toll-like (TLRs) são recetores vitais no reconhecimento de padrões que identificam patógenos invasores. CL097, um agonista de TLR7 e TLR8, e Poly (I:C), um agonista de TLR3, possuem capacidades imunomodulatórios já reconhecidas. Adicionalmente, β-glucano, que ativa células imunes através de recetores como o TLR2/6, dectina-1 e CR3, também exibe potencial imunomodulatório. Notavelmente, partículas de glucano (GPs) extraídas de levedura de padeiro (Saccharomyces cerevisiae) são uma das principais fontes responsáveis por esse efeito. Por outro lado, apresentam-se como um sistema de entrega de fármacos promissor, encapsulando de forma eficaz diferentes tipos de compostos tirando proveito das capacidades imunomodulatórias dos mesmos. Tendo em conta essas características, o objetivo deste trabalho consiste em gerar partículas de β-glucano (GPs) a partir de levedura de padeiro, encapsulando CL097, Poly (I:C) e uma proteína spike do SARS-CoV-2. Com essas formulações, esperamos avaliar se a combinação destes compostos conseguem induzir uma resposta imune e funcionar como adjuvantes de vacinas em diferentes situações: estudos in vitro usando células de murganho, neutrófilos e PBMCs humanos; bem como um estudo in vivo em murganhos.As GPs foram obtidas por uma série de extrações alcalinas e ácidas, e o CL097 e o Poly (I:C) foram encapsulados através de gradiente osmótico, em diferentes proporções de GPs:CL097 e GPs:Poly (I:C) de forma determinar as encapsulações ideais. O tamanho das partículas e o potencial zeta foram determinados por Espalhamento de Luz Dinâmica (DLS) e Espalhamento de Luz Eletroforética (ELS), respetivamente. A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), a produção de óxido nítrico (NO) e a viabilidade celular (ensaio de MTT) foram avaliadas na linha celular de macrófagos de murganhos, RAW 264.7. A produção de ROS também foi avaliada em neutrófilos isolados de buffy coats humanos. Adicionalmente, a quantificação de citocinas foi realizada por ELISA em esplenócitos de murganho C57BL/6, nas RAW 264.7 e em neutrófilos humanos. O antigénio do SARS-CoV-2 selecionado foi incorporado nas GPs-CL097 e a formulação foi avaliada em estudos de imunização em murganhos C57BL/6 como uma vacina oral. Os murganhos foram inicialmente imunizados via subcutânea, seguida por imunizações orais a cada duas semanas (3 no total). Fezes e amostras de sangue foram recolhidas antes de cada imunização e no final do ensaio. Adicionalmente, lavagens nasais e vaginais foram recolhidas no último dia de forma a avaliar a produção de anticorpos, enquanto as células do baço e o fígado foram recolhidos para a quantificação de citocinas.Após o processo de extração as GPs apresentaram um tamanho de aproximadamente 5,3 ± 0,6 μm e uma carga superficial neutra, 2,9 ± 0,4 mV. Em relação à produção de ROS, tanto as GPs vazias quanto as GPs carregadas com CL097 e Poly (I:C) revelaram uma resposta dependente da concentração e um efeito sinérgico para as concentrações mais baixas. Em relação à produção de NO, o CL097 induz uma resposta mais proeminente sozinho, embora as GPs-Poly (I:C) tenham promovido uma resposta superior. Foi observada uma produção de TNF-α e IL-6 induzida pelo CL097 tanto nos esplenócitos como nas RAW 264.7, enquanto as GPs apenas conseguiram induzir TNF-α. O Poly (I:C), por outro lado, foi capaz de induzir uma resposta nas RAW 264.7, demonstrando um efeito sinérgico com as GPs na produção de TNF-α, por outro lado, este foi o responsável pela produção de IL-6 nas GPs-Poly. As GPs promoveram a proliferação celular em PBMCs após 24 h de incubação. Adicionalmente, o CL097 sozinho foi capaz de gerar um efeito oxidativo em neutrófilos, mas foi incapaz de induzir a produção de citocinas, à semelhança das GPs e Poly (I:C). Todas as concentrações testadas demonstraram viabilidade celular acima de 70 %. No ensaio in vivo, foi observada uma resposta de Th1/Th2 equilibrada em relação à produção de IgG e os subtipos de IgG no soro de sangue. Em relação à produção de sIgA nas mucosas, a vacina foi capaz de induzir uma resposta humoral na mucosa nasal (1/5), enquanto que quase todos os animais responderam na mucosa gastrointestinal (4/5). Por outro lado, a formulação também gerou uma resposta imune Th1 e Th17 com a libertação de IFN-γ e IL-17 nos esplenócitos e IFN-γ no fluido intersticial do tecido hepático.Em suma, a formulação da vacina oral GP + agonista de TLR + antigénio representa um avanço fundamental para respostas imunes fortes contra o SARS-CoV-2. Oferece uma ativação imunológica potente, uma estratégia celular e humoral abrangente e explora a sinergia entre GP e agonistas de TLR, fornecendo uma base para epidemias causadas por vírus atuais e futuros.