RESEARCH & LABORATORY INTERNSHIP IN ANDROLOGY/MALE INFERTILITY: EFFECTS OF CRYOPRESERVATION ON SPERMATIC PARAMETERS, DNA INTEGRITY AND MITOCHONDRIAL ACTIVITY

Abstract

A saúde reprodutiva masculina, sendo o foco central da andrologia, aborda diversos temas, desde a infertilidade, contraceção masculina, disfunção erétil à senescência masculina. O presente relatório de estágio aborda dois aspetos fundamentais e desafiantes para os estudos da fertilidade masculina: a análise da fertilidade masculina (secção A) e a sua preservação (secção B).A secção A surge na sequência do desenvolvimento de um estudo transversal retrospetivo em que foram analisadas as características populacionais dos homens que frequentam as consultas de fertilidade e dos dadores de sémen. Consequentemente, foram analisados relatórios citomorfobioquímicos de sémen e resultados de estudos citogenéticos e moleculares de mais de 1000 homens. A incidência de anomalias citogenéticas nos homens inférteis residentes em Trás-os-Montes e Alto Douro foi de 2,6%, não tendo sido detetada qualquer microdeleção no cromossoma Y. Por fim, as avaliações de fertilidade no Centro Hospitalar de Trás-os-Montes e Alto Douro (CHTMAD) foram maioritariamente em homens com excesso de peso, com mais de 35 anos de idade, com infertilidade primária e hábitos de vida muito semelhantes aos da população portuguesa (masculina), em geral.A secção B, por sua vez, descreve um estudo piloto sobre o efeito dos antioxidantes astaxantina (ASTX) e vitamina E (VE) na criopreservação de espermatozoides. A criopreservação por congelação rápida foi efetuada em seis amostras normozoospérmicas, divididas em três grupos principais de 0, 2,5 e 5,0% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO). Para os dois últimos grupos, o meio de congelação foi suplementado com diferentes concentrações de ASTX e VE (0, 15, 25 μM de ASTX, 5 mM de VE e 25 μM de ASTX + 5 mM de VE). Para cada grupo, foram utilizadas alíquotas de sémen processado (sem plasma seminal), com uma concentração ajustada de 20 milhões/ml de espermatozoides. O descongelamento foi efetuado após duas semanas. A motilidade dos espermatozoides, a vitalidade (Eosina Y 0,5%), a morfologia e a fragmentação do DNA (Ensaio do Cometa Alcalino) foram avaliadas antes e após a congelação. O VE foi o antioxidante com a pior performance para a motilidade total (10%) e vitalidade (14%) dos espermatozoides. DMSO a 5% foi geralmente mais benéfico para todos os parâmetros estudados, com uma melhoria significativa da vitalidade dos espermatozoides (40,8%) e redução dos danos no DNA (22,2%), em relação ao grupo de controlo. Para mais, a ASTX a 5,0% DMSO apresentou um acentuado impacto no combate aos danos no DNA. As concentrações de 15 e 25 μM resultaram nos menores danos ao DNA observados (29,8% e 34,3%, respetivamente). Em comparação, o grupo de controlo apresentou valores significativamente mais elevados (60,8%). Estes resultados sugerem que 5,0% DMSO e ASTX seja, para a criopreservação, uma combinação promissora capaz de melhorar a vitalidade dos espermatozoides e reduzir os danos no DNA. No entanto, é crucial encontrar o equilíbrio correto entre estas duas substâncias para evitar efeitos tóxicos. Compreender a interação entre DMSO, ASTX, e as suas concentrações pode ser essencial para a elaboração de estratégias eficazes de criopreservação de esperma e, portanto, carece de uma investigação mais aprofundada. Em suma, o estágio em andrologia/infertilidade masculina proporcionou uma exposição prática ao trabalho laboratorial relevante para a andrologia e fertilidade masculina, uma oportunidade para participar em projetos de investigação e gerar conhecimento. Este último tendo sido realizado através da publicação dos resultados da investigação e de apresentações em conferências.

As the central focus of andrology, male reproductive health deals with various topics, from infertility, male contraception, and erectile dysfunction to male senescence. The present internship report addresses two key aspects that currently challenge male fertility studies: male fertility analysis (Section A) and preservation (Section B). Section A follows the development of a retrospective cross-sectional study in which the populational traits of men attending fertility consultations and semen donors alike were subjected to analysis. Consequently, the results of the semen analysis, cytogenetic and molecular studies of more than 1,000 men were reviewed. The incidence of cytogenetic abnormalities in infertile male patients residing in Trás-os-Montes and Alto Douro was 2.6%, with no detection of microdeletion of the Y chromosome. Lastly, male fertility evaluations at the Trás-os-Montes and Alto Douro Hospital Centre (CHTMAD) were mainly composed of overweight men over 35 years of age who suffer from primary infertility with lifestyle habits that closely resembled those reported for the (male) Portuguese population in general. Section B describes a pilot study on the effect of the antioxidants astaxanthin (ASTX) and vitamin E (VE) on sperm cryopreservation. Rapid freezing cryopreservation was performed on six normozoospermic semen samples, divided into three main groups of 0, 2.5 and 5.0% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO). Furthermore, the last two groups had their freezing medium supplemented with different concentrations of ASTX and VE (0, 15, 25 μM of ASTX, 5 mM VE and 25 μM ASTX + 5 mM VE) in their respective DMSO concentration (v/v). For each group, washed semen aliquots were used, with a concentration adjusted to 20 million/ml sperm cells. Thawing was performed after two weeks. Sperm motility, vitality (Eosin Y 0,5%), morphology, and DNA fragmentation (Alkaline Comet-Assay) were evaluated before freezing and after thawing. VE was the antioxidant with the poorest outcome for sperm total motility (10%) and vitality (14%). Five per cent DMSO was generally more beneficial for all the studied parameters, with significant improvement in sperm vitality (40.8%) and DNA damage (22.2%), over the control group. Moreover, ASTX at 5.0% DMSO displayed the most marked impact on DNA damage. The concentrations of 15 and 25 μM resulted in minor DNA damage (29.8% and 34.3%, respectively). In comparison, the control group exhibited significantly higher values (60.8%). Furthermore, our findings suggest that 5.0% DMSO in combination with ASTX shows promise in improving sperm vitality and reducing DNA damage. However, finding the right balance between these two substances is crucial to avoid toxic effects. Understanding the interplay between DMSO, ASTX, and their concentrations can be essential for effective sperm cryopreservation strategies and thus merits further investigation. In summary, the research and laboratory internship in andrology/male infertility provided practical exposure to laboratory work relevant to andrology and male fertility, an opportunity to participate in research projects and generate knowledge. The latter was accomplished through the publishing of research findings and presentations at conferences.