VALIDAÇÃO E IMPLEMENTAÇÃO DO KIT DE AMPLIFICAÇÃO INVESTIGATOR® 26PLEX QS EM AMOSTRAS FORENSES

Abstract

A individualidade humana concede a cada indivíduo uma personalidade jurídica e uma identidade pessoal. Esta unicidade possibilita a identificação humana que se constitui como o alicerce da Genética e Biologia Forenses. As perícias realizadas neste âmbito centram-se na determinação e comparação de perfis genéticos, sendo o método de eleição o estudo e caracterização de marcadores polimórficos de ADN (Ácido Desoxirribonucleico), designados Short Tandem Repeats (STRs).O desenvolvimento da metodologia de PCR (Polymerase Chain Reaction) representa um marco na Genética Forense, dado que possibilitou a obtenção de múltiplas cópias de uma sequência específica de ADN através da sua amplificação. O contínuo desenvolvimento científico e o elevado poder probatório desta perícia no que concerne a questões jurídicas e judiciais impõem uma atualização constante dos procedimentos laboratoriais implementados, visando incrementar a confiabilidade dos resultados obtidos.O kit Investigator® 26plex QS, da QIAGEN, assenta numa reação de PCR multiplex, que permite a amplificação simultânea da Amelogenina, 24 STRs e 2 Sensores de Qualidade. Os Sensores de Qualidade inclusos neste kit de amplificação permitem inferir sobre o sucesso da reação de PCR e a qualidade da amostra, alertando, igualmente, para a presença de inibidores. O objetivo do presente trabalho consistiu na avaliação da adequabilidade deste kit à casuística do laboratório, por meio de uma validação interna extensiva que visou a sua posterior implementação no SGBF-C.Com este trabalho pretendeu-se descrever os procedimentos e parâmetros utilizados no decurso da validação interna deste ensaio, que encalçaram as diretrizes do SWGDAM (Scientific Working Group on DNA Analysis Methods), assim como relatar os resultados obtidos no decorrer do mesmo. Este projeto foi dividido em dois momentos, primeiramente houve a necessidade de fixar critérios únicos de análise que permitissem validar e interpretar os resultados obtidos nos ensaios subsequentes. De seguida, pretendeu-se aferir odesempenho do kit, verificando a sua concordância com metodologias normalizadas e avaliando a sua sensibilidade, especificidade, robustez e precisão, assim como a sua eficiência face a amostras biológicas degradadas ou com a presença de inibidores. Complementarmente, foram efetuadas alterações ao protocolo original com vista a obter uma metodologia protocolar otimizada à rotina laboratorial do Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro (SGBF-C). Este estudo compreendeu a análise de diferentes amostras biológicas provenientes de substratos diferenciados, incidindo o projeto sobre amostras problema e de referência, assim como amostras simuladas, constatando-se que a diferente etiologia condicionou a metodologia em uso para cada material biológico. Não obstante, o procedimento global incluiu a extração de ADN com recurso ao Prep-n-Go™ Buffer e PrepFiler Express™ Forensic DNA Extraction Kit, seguindo-se a sua quantificação, quando necessária, pelo Quantifiler™ Trio Quantification Kit e, posterior amplificação pelo Investigator® 26plex QS. A eletroforese capilar realizou-se no sequenciador automático Applied Biosystems™ 3500 Genetic Analyzer, seguindo-se a análise dos eletroferogramas através do GeneMapper™ ID-X Software v1.6..Com este trabalho foi possível caracterizar as principais vantagens do kit Investigator® 26plex QS, assim como as suas limitações. Este kit de amplificação de ADN humano evidencia elevada robustez, confiabilidade, especificidade e sensibilidade. Foi possível ainda constatar uma elevada concordância entre este novo kit de amplificação e os atualmente implementados no SGBF-C, assim como provar a sua adequabilidade à análise de amostras forenses.

Human singularity grants each individual a legal personality and a personal identity. This uniqueness enables human identification, which constitutes the fundament of Forensic Genetics and Biology. The expertise conducted in this field focuses on the determination and comparison of genetic profiles, with the method of choice being the study and characterization of polymorphic DNA (Deoxyribonucleic Acid) markers, known as Short Tandem Repeats (STRs). The development of the PCR (Polymerase Chain Reaction) methodology represents a breakthrough in forensic genetics due to its proficiency in creating multiple copies of a specific DNA region by its amplification. The constant scientific advances and the high evidentiary power of this expertise concerning legal and judicial issues lead to the continuous upgrading of the laboratory-implemented procedures, in order to increase the reliability of the results obtained. The Investigator® 26plex QS amplification kit, from QIAGEN, is based on a multiplex PCR, that enables the simultaneous amplification of 24 STRs, 2 Quality Sensors and Amelogenin. The Quality Sensors included in this amplification kit provide insight into the sample quality and the PCR's success while alerting to the presence of inhibitors. The purpose of this study was to evaluate the suitability of this kit for laboratory casuistry, through extensive internal validation aimed at its subsequent implementation at the Forensic Genetic and Biology Service, Central branch (SGBF-C) of the National Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences. This research sought to describe the procedures and parameters employed in the internal validation of this essay which followed the guidelines of the SWGDAM (Scientific Working Group on DNA Analysis Methods), as well as report the results obtained throughout. This project was composed of two phases. Firstly, defining analytical thresholds was essential to establish unique analytical criteria that would allow the results obtained in subsequent assays to be validated and interpreted. Thereupon, it intended to gauge the kit’s performance, by evaluating its concordance with normalized methodologies while assessing its sensitivity, specificity, robustness, and precision, as well as its efficiency in the presence of degraded or inhibited samples.Furthermore, amendments were made to the original protocol to achieve an optimised methodology protocol adapted to the SGBF-C laboratory routine. This study comprised the analysis of different samples from various substrates, focusing on problem and reference samples, as well as simulated ones, denoting that the different aetiology conditioned the methodology in use for each biological material. Nonetheless, the general procedure included DNA extraction using the Prep-n-Go™ Buffer and PrepFiler Express™ Forensic DNA Extraction Kit, its quantification, when necessary, using the Quantifiler™ Trio Quantification Kit and subsequent amplification using Investigator® 26plex QS. Capillary electrophoresis was performed in the Applied Biosystems™ 3500 Genetic Analyzer, followed by the analysis of the electropherograms using the GeneMapper™ ID-X Software v1.6. Through this work, it was possible to characterize the main advantages of the Investigator® 26plex QS kit, as well as its limitations. This human DNA amplification kit evidences high robustness, reliability, specificity, and sensitivity. It was further proven that there is a high concordance between this novel amplification kit and those currently implemented in the SGBF-C, thus proving its suitability for the analysis of forensic samples