Terapia Génica com Ondas Fotoacústicas

Abstract

Gene therapy involves a process that requires the genetic manipulation of specific cells using nucleic acids, through the replacement or correction of altered genes for a therapeutic purpose. The main difficulty with existing gene therapy methods is in permeating the cell membrane for safe DNA delivery. The aim of this work was to use a non-viral transfection method mediated by laser-induced pressure waves. Light-pressure transducers, known as piezophotonic materials, are composed of a chromophore with a high light-absorption capacity confined in a material with high thermoelastic expansion. Laser pulses in the nanosecond range (8 ns) and picosecond range (30 ps), with a wavelength at 1064 nm, were absorbed by the piezophotonic material fuligem-PDMS, which exhibits a high efficiency in converting light into pressure, giving rise to photoacoustic waves capable of enhancing cell membrane permeability, facilitating the entry of the plasmid encoding the green fluorescent protein (gWizGFP).In order to achieve different pressure gradients, low laser fluences (60 mJ cm-2 and 100 mJ cm-2) were used, resulting in the generation of high absolute pressures (60 bar and 100 bar), and relatively low-frequency bandwidths (10 MHz), compared to other materials studied by our research group (MnTPP). This technique has proven to be safe, with cell viability exceeding 95% even after several minutes of exposure to photoacoustic waves. This is a highly advantageous feature, and it is also possible to expose the materials to successive laser pulses without damaging them.Transfection results were evaluated using fluorescence microscopy and flow cytometry techniques. These results showed that the nanosecond laser with an 8 ns pulse had lower efficiency than the picosecond laser with a 30 ps pulse, achieving a transfection efficiency of approximately 5% in COS-7 cell line. This result indicates that the presence of higher pressures, inducing higher pressure gradients, is highly relevant for cell membrane permeabilization. In the future, it is expected that after some optimizations, this technique can be introduced into clinical practice.

A terapia genética consiste num processo que envolve a manipulação genética de células especificas com o uso de ácidos nucleicos, através da substituição ou correção de genes alterados com um objetivo terapêutico. A principal dificuldade dos métodos de terapia genética existentes é em permear a membrana celular para uma entrega segura do DNA. O objetivo deste trabalho consistiu no uso de um método de transfeção não-viral mediado por ondas de pressão induzidas por laser. Os transdutores luz-pressão, conhecidos como materiais piezofotónicos são formados por um cromóforo com elevada capacidade de absorção de luz confinado num material com elevada expansão termoelástica. Pulsos de laser na ordem dos nanossegundos (8 ns) e picossegundos (30 ps), com comprimento de onda de 1064 nm, absorvidos pelo material piezofotónico fuligem-PDMS, com elevada eficiência de conversão da luz em pressão, originaram ondas fotoacústicas capazes de aumentar a permeabilidade da membrana celular facilitando a entrada do plasmídeo codificador da proteína verde fluorescente.De forma a obter diferentes gradientes de pressão, usando fluências de laser relativamente baixas (60 mJ cm-2 e 100 mJ cm-2) foi possível gerar ondas com pressões absolutas elevadas (60 bar e 100 bar), e larguras de banda de frequências relativamente baixas (10 MHz), em relação a outros materiais estudados pelo nosso grupo de investigação (MnTPP). Esta técnica mostrou ser segura, apresentando uma viabilidade celular superior a 95% mesmo após vários minutos de exposição às ondas fotoacústicas. Tal, é uma característica bastante vantajosa, além de que é possível expor os materiais a sucessivos pulsos de laser sem os danificar.Os resultados da transfeção foram avaliados usando as técnicas de microscopia de fluorescência e de citometria de fluxo. Estes resultados demonstraram que o laser de nanossegundos com um pulso de 8 ns apresentou menor eficiência do que o laser de picossegundos com pulso de 30 ps, onde se obteve uma eficiência de transfeção de aproximadamente 5% em células da linha celular COS-7. Este resultado indica que a presença de maiores pressões, induzindo maiores gradientes de pressão, tem elevada relevância para a permeabilização da membrana celular. Futuramente, espera-se que após algumas otimizações, esta técnica possa ser introduzida na prática clínica.