SEEKING FOR FUNGAL SIALIDASE INHIBITORS

Abstract

As alergias respiratórias desde sempre foram afetando a população mundial, podendo apresentar formas mais graves como asma severa que pode ser fatal. Grande parte dos fungos responsáveis por estas alergias são fungos filamentosos. Um destes fungos é Alternaria alternata, para o qual 3% da população em Portugal tem sensitização. Num estudo prévio, a análise proteómica deste fungo mostrou uma grande expressão de sialidase, uma enzima responsável por clivar ácidos siálicos, que são monossacarídeos com nove carbonos que se ligam a glicoconjugados nas membranas da célula. O ácido siálico está presente em grande abundância nas vias respiratórias e em agentes patogénicos, as sialidases participam nos processos de adesão, colonização e infeção destes tecidos, sendo por isso um importante alvo terapêutico.Os principais objetivos desta tese foram tentar caracterizar a sialidase de A. alternata, determinando a sua atividade e localização, assim como sintetizar quimicamente compostos que inibam a sua atividade. Foram realizados ensaios de atividade que permitiram observar maior atividade da sialidase nos esporos do que nas hifas e também que a enzima parece ser intracelular, pois apresenta maior atividade nas frações intracelulares. Também se observou atividade em vesiculas extracelulares, provando que esta é transportada por vesiculasextracelulares para fora da célula.Foi testado um inibidor da sialidase do vírus Influenza, o Oseltamivir, um fármaco clinicamente usado e ainda quatro derivados de chalconas que foram previamente sintetizados. O oseltamivir apresentou uma resposta dependente da concentração, o IC50 determinado foi de 4,6 mM, um valor cerca de 3000 vezes superior ao IC50 da sialidase do vírus Influenza. Quanto aos derivados de chalconas, estes não mostraram qualquer atividade inibitória na sialidase de A. alternata. Por outro lado, foi iniciada a síntese de inibidores de sialidases com o intuito de determinar a especificidade da sialidase de A. alternata. Para tal, tentou-se sintetizar ácido siálico, um precursor do Neu5Ac2en e do Kdn2en, que são inibidores específicos de sialidases e de sialidases fúngicas chamadas Kdnase, respetivamente.Contudo não foi possível finalizar esta síntese, devido a baixos rendimentos, apenas conseguindo obter um percursor de ácido siálico; uma vez que não se obteve acido siálico não foi possível prosseguir para a síntese dos inibidores pretendidos. Contudo, foi possível otimizar a sua síntese química de acordo com a literatura descrita, tendo-serealizado uma tentativa de síntese por via enzimática.Em suma, com este trabalho foi possível estudar pela primeira vez a sialidase de A. alternata, e foram feitos grandes progresso na otimização da síntese química de inibidores de sialidases, os quais poderão ter uma aplicação relevante na prevenção da colonização das vias aéreas superiores por A. alternata, e consequentemente, prevenção de sintomas de alergia provocados por este fungos.

Respiratory allergies have always affected the world's population; serious forms such as severe asthma that can be fatal to the patients. Most of the fungi responsible for these allergies are filamentous fungi. One of these fungi is Alternaria alternata, to which 3% of the population in Portugal is sensitized. In a previous study, proteomic analysis of this fungus showed high expression of sialidase, an enzyme responsible for cleaving sialic acids, which are nine-carbon monosaccharides that bind to glycoconjugates in cell membranes. Sialic acids are present in great abundance in the airways; in pathogenic agents, sialidases participate in the processes of colonization and infection of these tissues, thus being an important therapeutic target.The main objectives of this thesis were centred in the characterization of the A. alternata sialidase, determining its activity and location, as well as to chemically synthesize compounds that inhibit its activity.Activity assays showed that the sialidase activity is higher in spores than in hyphae and that the enzyme appears to be intracellular, as the intracellular fractions showed higher activity. The sialidase activity was also observed in extracellular vesicles, proving that these structures transport sialidase out of the fungal cell.Oseltamivir, an inhibitor of the Influenza virus sialidase, clinically used, and four chalcone derivatives previously synthesized, were tested to determine their inhibitory activity against A. alternata sialidase. Oseltamivir showed a concentration-dependent response, with a IC50 of 4.6 mM, a value about 3000 times higher than the IC50 of the sialidase of the Influenza virus. In contrast, the chalcone derivatives did not show any inhibitory activity on A. alternata sialidase.On the other hand, the synthesis of sialidase inhibitors was initiated to determine the specificity of the A. alternata sialidase. For this, sialic acid was synthesized, a precursor and Neu5Ac2en and Kdn2en which are specific inhibitors of sialidases and of the fungal sialidase termed Kdnase, respectively.However, it was not possible to obtain this compound, only obtaining a precursor of the sialic acids, because of the low produced yields, and therefore it was not possible tocontinue with the synthesis of the intended inhibitors. Nevertheless, it was possible to optimize its chemical synthesis according to the described literature and an attempt was also made to synthesize it enzymatically.In conclusion, with this work it was possible to study the sialidase of A. alternata for the first time, and great progress was made in optimizing the chemical synthesis of sialidase inhibitors, which may have a relevant application in the prevention of colonization of the upper airways by A. alternata, and consequently, prevention of allergy symptoms caused by this fungus.