Quantificação do dano biológico induzido pelo Ra-223 em culturas celulares de cancro da próstata metastático

Abstract

Prostate cancer (PCa) holds the second position among the most frequently diagnosed neoplasms and ranks as the fifth leading cause of oncological mortality in men. The most advanced stage of PCa, metastatic castration-resistant PCa, is closely associated with the development of bone metastases and with a very unfavourable prognosis due to therapeutic limitations. In this context, the use of the radionuclide therapy, especially the radiopharmaceutical radium-223 dichloride, an alpha emitter that mimics calcium and it is readily deposited into areas exhibiting high osteoblastic activity and bone renewal (such as bone metastases in PCa), has shown a promising potential. However, its precise mode of interaction and effects on the metastatic microenvironment are not yet fully understood limiting its clinical applicability, essentially due to the absence of molecular-level radiobiological and dosimetric studies.Thus, this project was developed to assess the radiobiological effect of radium-223 in 3D cell cultures (spheroids) of metastatic PCa cells and conduct dosimetric studies involving two- and three-dimensional cell models of metastatic PCa. To achieve this, a spheroid cellular model was established using LNCaP or PC3 cells, both representative metastatic PCa cell lines, through the liquid overlay culture technique. The radiobiological effects of radium-223 were assessed five or seven days after exposing the spheroids to different volumetric activities (from 55 to 7 040 Bq/mL) for 24 hours. Specifically, the effects of the radiopharmaceutical were evaluated on morphometry, proliferation, migration, and cell invasion. Radium-223 in vitro dosimetry was performed following the MIRD formalism, through the determination of S-values for PC3 and LNCaP cells followed by absorbed doses calculation at different volumic activities and radiation exposure durations, accounting with the diverse experimental approaches in vitro.Results showed that irradiation of PC3 and LNCaP cells’ spheroids led to progressive disintegration at the periphery of these structures, resulting in a reduction in size with increasing initial volumic activity compared to non-irradiated spheroids. Additionally, cell proliferation was affected by radium-223 exposure, with a statistically significant decline observed when spheroids were exposed to volumic activities from 55 Bq/mL (LNCaP) or 3 520 Bq/mL (PC3). Furthermore, a more pronounced decrease in cellular proliferation was observed in LNCaP cells’ spheroids compared to PC3 cells’ spheroids under the same irradiation conditions, indicating a greater radiosensitivity of LNCaP cells to radium-223. Migration and invasion assays in 3D PC3 cell structures demonstrated fewer migratory and invasive cells at the spheroid periphery with increasing initial volumic activity.Regarding radium-223 dosimetry, the absorbed dose per cell increased proportionally with internalized activity, exposure duration, and decreased concentration and cellular dimensions. Moreover, analysis of the influence of neighbouring cells on the total absorbed dose by a cell indicated that these cells contributed with a little fraction for the total absorbed dose, which contribution decreases as intercellular distance increases. Results obtained from cellular protein content assay supported the findings of the proliferation assay, confirming greater radiosensitivity in the LNCaP cell line. In clonogenic assays, the mean lethal dose values were consistent with previous studies and indicated a biological effect, particularly during the initial time of exposure to radium-223. Lastly, simulation curves demonstrated that spheroids exhibited greater radioresistance compared to monolayer cultures, due to the spatial architecture of 3D structures and the limited penetration depth of alpha particles emitted by radium-223.To conclude, the presented results showed a cytotoxic effect of radium-223 on PCa cells’ spheroids, in particularly a decrease in their size and a reduced cell viability, as well as impairing the migratory and invasive cells capabilities. Simultaneously, it was observed that the development of spheroids of varying sizes and the biological impact of radium-223 within these structures depends on the type and on the initial number of seeded cells. Additionally, the absorbed dose by a cell was demonstrated to be dependent on a set of factors related to the kinetics of radium-223, exposure times, and the initially administered radiopharmaceutical activity. Given these findings and considering the knowledge acquired, the optimization of current therapeutic options that incorporate radium 223 will be an added value in the treatment of patients with metastatic PCa, contributing to increased overall survival and improved quality of life.

O cancro da próstata (CaP) ocupa a segunda posição na lista das neoplasias mais frequentemente diagnosticadas, sendo a quinta causa de morte oncológica no sexo masculino. O estádio mais avançado de CaP, denominado de CaP metastático resistente à castração, está maioritariamente associado ao desenvolvimento de metástases ósseas e a um prognóstico muito desfavorável devido à escassez de terapêuticas. Nesta situação, o recurso à terapia de radionuclídeos com o dicloreto de rádio 223, um emissor alfa mímico do cálcio com afinidade pelas metástases ósseas de CaP, tem vindo a demonstrar elevado potencial. Todavia, as lacunas no conhecimento sobre os efeitos radiobiológicos e dosimétricos do rádio-223, inclusive a nível molecular, são apontados como limitadores da eficácia clínica.Neste sentido, este projeto visou a avaliação dos efeitos radiobiológicos e dosimétricos do rádio-223 em culturas celulares 3D (esferoides), sendo os estudos dosimétricos alargados aos modelos celulares 2D. Para tal, foi utilizado um modelo celular de esferoides, estabelecido a partir de células LNCaP ou PC3, ambas linhas celulares de CaP metastático, através da técnica de cultura por sobreposição líquida. Os efeitos radiobiológicos do rádio-223, em específico na morfometria, viabilidade, migração e invasão celulares, foram avaliados cinco ou sete dias após a exposição dos esferoides a diferentes atividades volúmicas iniciais (55 – 7 040 Bq/mL), durante 24h. A dosimetria do rádio-223 em modelos celulares in vitro foi realizada de acordo com o formalismo MIRD, através da determinação dos S values, para as células PC3 e LNCaP, e do cálculo da dose absorvida para diferentes atividades volúmicas e tempos de irradiação, tendo em conta as diferentes abordagens experimentais realizadas in vitro.Os resultados obtidos mostraram que a irradiação dos esferoides de células PC3 e LNCaP induziu uma desintegração progressiva na periferia dos esferoides, que se traduz na redução do seu tamanho e da viabilidade celular com o aumento da atividade volúmica inicial administrada. O decréscimo da viabilidade celular dos esferoides foi estatisticamente significativo após a exposição a atividades volúmicas iguais ou superiores a 55 Bq/mL (LNCaP) ou 3 520 Bq/mL (PC3). Além disso, verificou-se uma viabilidade menor em esferoides de células LNCaP do que em esferoides de células PC3, quando expostos às mesmas condições de irradiação, sugerindo uma maior radiossensibilidade ao rádio 223 para as células LNCaP. Adicionalmente, os ensaios de migração e invasão celular evidenciaram um decréscimo das células PC3 migratórias e invasoras na periferia dos esferoides com o aumento da atividade volúmica inicial.A dosimetria do rádio 223 mostrou um aumento da dose absorvida por célula de acordo com o acréscimo da atividade internalizada e, por conseguinte, da atividade integrada no tempo, com o tempo de exposição ao radiofármaco, assim como com a diminuição da concentração e das dimensões celulares. Para além disso, a avaliação da influência da vizinhança celular na dose total absorvida por uma célula demonstrou que as células vizinhas são responsáveis por uma pequena fração na totalidade da dose que uma célula absorve, tanto menor quanto maior é a distância intercelular. Os resultados obtidos em condições de avaliação do conteúdo proteico celular corroboraram o sugerido através do ensaio de viabilidade, denotando também uma maior radiossensibilidade para a linha celular LNCaP. Nas condições subjacentes ao ensaio clonogénico, os valores de dose letal média alcançados foram concordantes com os estudos anteriormente realizados, evidenciando ainda a ocorrência do efeito biológico sobretudo num período inicial de exposição ao rádio 223. Por fim, e de acordo com as curvas de simulação obtidas, verificou-se uma maior radiorresistência dos esferoides comparativamente às culturas em monocamada devido, essencialmente, à arquitetura espacial das estruturas 3D e ao baixo poder de penetração das partículas alfa emitidas pelo rádio 223.Concluindo, os resultados obtidos demonstram o efeito citotóxico do rádio 223 em esferoides de células de CaP, em particular na diminuição do seu tamanho e no decréscimo da viabilidade celular e da capacidade migratória e invasiva das células. Em simultâneo, verificou-se ainda que o desenvolvimento de esferoides de diferentes dimensões e o efeito biológico do rádio 223 nestas estruturas é dependente do tipo e do número inicial de células semeadas. Por outro lado, a dose absorvida por uma célula demonstrou-se dependente de um conjunto de fatores associados à cinética do rádio 223, aos tempos de exposição e à atividade de radiofármaco inicialmente administrada. Perante estes factos, e tendo em conta os conhecimentos obtidos, a otimização das opções terapêuticas atuais que incorporam o rádio 223 será uma mais-valia no tratamento de doentes com CaP metastático, contribuindo para o aumento da sobrevivência global e da melhoria da qualidade de vida.