3D printing of skeletal tissue constructs: from processing to biological evaluation

Abstract

The present work: “3D printing of skeletal tissue constructs: from processing to biological evaluation”," aimed to develop 3D scaffolds to be used for tissue engineering of meniscal tissue. The polymers used to develop the scaffolds were α-amino acids based poly (ester amide)s (PEAs). Since the meniscus is mainly composed of water and type I collagen, the structure of PEAs was carefully selected to better mimic the composition of this tissue. Thus, PEAs were based on L-alanine, and glycine since these are the most abundant α-amino acids in type I collagen. To increase the affinity of PEA to water, Jeffamine-600 was also used as monomer.PEAs were prepared by solution polycondensation between diamines based on α-amino acids (bis-α-(L-amino acid)-α, ω-alkylene diesters (BAADs)) and a N-hydroxysuccinimide ester of sebacoyl chloride (sebacinate (OSu)2). The BAADs were prepared by a Fischer esterification reaction between α-amino acids (L-alanine and glycine) and a diol (1,6-hexanediol) in the presence of a catalyst, p-toluenesulfonic acid monohydrate (pTSA).The chemical structures of the PEAs were confirmed by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H NMR). The molecular weight distribution of the PEAs was measured by size exclusion chromatography (SEC). In general, the L-alanine-based PEAs (PEA-ala) had higher molecular weight than the PEAs containing both L-alanine and glycine (PEA-ala-gly) or L-alanine, glycine, and jeffamine (PEA-ala-gly-jeff).Differential scanning calorimetry (DSC) results showed that all three PEAs were semi-crystalline but could not crystallize after melting and became amorphous. As for the glass transition temperature (Tg), the L-alanine-based PEAs had the highest value, while the PEAs with jeffamine in their structure had the lowest value. The contact angle measurements showed that the PEAs with jeffamine in their structure were more hydrophilic than the other PEAs.The first attempt to process the PEAs was carried out using the melt electrospinning writing (MEW). Although it was possible to form fibers with the PEAs (50-60 kDa), a phenomenon of aggregation of the fibers affected the fabrication of 3D scaffolds. Only with PEAs with a molecular weight of 30-40 kDa it was possible to obtain a 3D scaffold, but this was too fragile. For this reason, it was decided to abandon the processing of PEAs by MEW and to try their processing by 3D printing. After an extensive optimization process, it was possible to obtain acellular 3D scaffolds from the PEAs by using a screw-assisted 3D printing process in a 3DDiscovery (RegenHU, Switzerland) equipment. For comparison purposes, 3D scaffolds of commercial poly(ɛ-caprolactone) (PCL) were also prepared. The scanning electron microscopy (SEM) analysis showed that the scaffolds presented filaments almost with the same diameter and pores almost of the same size, indicating the success of the 3D printing process. The scaffolds were also analyzed in terms of their mechanical properties by compression tests. The results showed that the PEA based scaffolds were softer than those based on PCL.After the physical characterization of the scaffolds, these were analyzed in terms of their cytotoxicity, by in vitro tests (live/dead assays and metabolic activity), using a human- derived C20A4 immortalized chondrocyte cell line. The results indicate that the scaffold prepared from the PEA-ala, synthesized using DMSO as solvent, is non-cytotoxic and allowed a better proliferation of the C20A4 cells when compared with the PCL scaffold. Although preliminary, these results suggest that the developed PEAs can be an interesting material to be used in meniscal tissue engineering.

O presente trabalho, intitulado “Impressão 3D de scaffolds para tecido esquelético: do processamento à avaliação biológica”, teve como objetivo desenvolver um scaffold 3D a partir debase poliesteramidas (PEAs) de base α-aminoácido para utilização na engenharia de tecido de menisco. Como o menisco é composto principalmente por água e colágenio do tipo I, a estrutura das PEAs foi selecionada para melhor imitar a composição deste tecido. Assim, as PEAs foram sintetizadas a partir de L-alanina e glicina, visto serem estes os α-aminoácidos mais abundantes no colagénio tipo I. Para aumentar a afinidade das PEAs com a água, também foi utilizada a Jeffamine-600, como monómero.As PEAs foram preparadas por policondensação em solução entre diaminas de base α-aminoácidos (BAADs)) e um éster de N-hidroxisuccinimida de cloreto de sebacoílo (sebacinato (OSu) 2). Os BAADs foram preparados por uma reação de esterificação de Fischer entre os α-aminoácidos (L-alanina e glicina) e um diol (1,6-hexanodiol) na presença de um catalisador, ácido p-toluenossulfónico monohidratado (pTSA).As estruturas químicas das PEAs foram confirmadas por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de protão (1H RMN). A distribuição do peso molecular das PEAs foi medida por cromatografia de exclusão molecular (SEC). Em geral, as PEAs à base de L-alanina (PEA-ala) tinham peso molecular mais elevado do que as PEAs contendo L-alanina e glicina (PEA-ala-gly) ou L-alanina, glicina e jeffamine (PEA-ala-gly-jeff).Os resultados obtidos na calorimetria diferencial de varrimento (DSC) mostraram que todas as PEAs eram semicristalinas, mas não conseguiram cristalizar após a fusão, tornando-se amorfas. Quanto à temperatura de transição vítrea (Tg), as PEA-ala apresentaram o maior valor, enquanto que as PEA-ala-gly-jeff apresentaram o menor valor. As medições do ângulo de contato mostraram que as PEA-ala-gly-jeff eram as mais hidrofílicas.A primeira tentativa de processar as PEAs foi feita utilizando a técnica de melt electrospinning writing (MEW). Embora tenha sido possível formar fibras com as PEAs (50-60 kDa), foi observado um fenómeno de agregação das fibras, inviabilizando a obtenção dos scaffolds 3D. Somente com PEAs de peso molecular de 30-40 kDa foi possível obter uma estrutura 3D, mas esta era muito frágil. Por este motivo, decidiu-se abandonar o processamento de PEAs pela técnica de MEW e tentar o seu processamento por impressão 3D. Após um extenso processo de otimização, foi possível obter scaffolds 3D acelulares de PEAs utilizando um processo de impressão 3D screw assisted no equipamento 3DDiscovery (RegenHU, Suiça). Para efeitos de comparação, também foram preparados scaffolds 3D de poli(ɛ-caprolactona) (PCL) comercial. A análise por microscopia eletrónica de varrimento (SEM) mostrou que os scaffolds apresentavam filamentos com diâmetro muito próximo e poros com tamanho muito próximo, indicando o sucesso do processo de impressão 3D. Os scaffolds também foram analisados quanto às suas propriedades mecânicas através de ensaios de compressão. Os resultados mostraram que os scaffolds produzidos a partir das PEAs eram menos rígidos do que os produzidos com PCL.Após a caracterização física dos scaffolds, estes foram analisados quanto à sua citotoxicidade, através de testes in vitro (ensaios live/dead e atividade metabólica), utilizando uma linha celular imortalizada de condrócitos humanos C20A4. Os resultados indicam que o scaffold obtido a partir da PEA-ala, sintetizada utilizando DMSO como solvente, não é citotóxica e permitiu uma melhor proliferação das células C20A4 quando comparada com a estrutura PCL. Embora preliminares, estes resultados sugerem que as PEAs desenvolvidas podem ser um material interessante para utilização na engenharia de tecido meniscal.