Prioritization of neuronal targets as mediators of cellular delivery of neurodegeneration therapeutics

Abstract

Doenças neurológicas acarretam um peso significativo nos serviços de saúde e afetam mais de mil milhões de pessoas no século XXI. Prevê-se que este número aumente no futuro devido ao crescimento e envelhecimento da população. As doenças neurodegenerativas (DND) são complexas e embora o envelhecimento seja um fator de risco significativo para o seu desenvolvimento, nomeadamente na doença de Alzheimer (DA) e na doença de Parkinson (DP), estas podem também ser influenciadas por uma série de fatores genéticos e ambientais 21. Sendo consideradas doenças complexas, as DND estão associadas a um grande número de alterações com grande impacto no cérebro e no seu funcionamento, nomeadamente défices cognitivos, disfunção motora e alterações comportamentais. As principais características das DND incluem alterações na conformação das proteínas, como emaranhados de tau e placas Aβ, interrompendo processos celulares normais e levando à morte de células neuronais. As terapias baseadas em intervenção genética, como as terapias direcionadas ao RNA, oferecem alterações específicas na expressão de proteínas com efeitos duradouros. Para serem usadas como uma ferramenta farmacológica no sistema nervoso central (SNC), são necessárias condições como entrega das moléculas terapêuticas no cérebro e dispersão pelos vários tecidos. Portanto, um veículo para garantir sua segurança e transporte eficaz através da barreira hematoencefálica (BBB) e a sua entrega na células-alvo é fundamental.Um dos mecanismos mais explorados para a entrega das moléculas terapêuticas através da BBB tem sido a transcitose mediada por recetores (RMT) e a transcitose mediada por transportador (CMT). Para que ocorra a sua entrega de forma eficaz por RMT ou CMT é requerido uma forte expressão do recetor alvo ou proteína transportadora em células endoteliais da BBB e a expressão mínima em tecidos periféricos.Neste projeto diferentes shuttles presentes na BBB serão explorados com a intenção de desenvolver uma molécula. Numa primeira etapa de priorização, foi realizada uma pesquisa in silico que nos permitiu reduzir extensivamente o número de alvos de interesse. A lista reduzida foi submetida a uma nova pesquisa no modelo neuronal NGN2, e o nível de expressão esperado foi comparado com os resultados obtidos através de Western blots. Isto levou a uma consequente redução ainda mais da lista de alvos de interesse para os quais havia anticorpos comerciais adequados. Além disso, também a presença na membrana dos recetores foi analisada. Utilizando diferentes técnicas de purificação, as proteínas foram separadas em fração membranar e citoplasmática, e analisadas com Western blots. Estudos adicionais para confirmar a localização na membrana dos alvos de interesse estão atualmente em progresso.

Neurological conditions are a significant healthcare burden affecting over one billion people in the 21st century, and it is expected to increase due to population growth and ageing. Neurodegenerative disorders (NDDs) are complex and although ageing is a significant risk factor, especially AD and PD, they can be influenced by a range of genetic and environmental factors. As heterogenous diseases, NDDs encompass a wide range of consequences on brain and its behaviour. These changes are known to be significant and diverse, including cognitive impairment, motor dysfunction and behavioural alterations. Key features of neurodegenerative diseases include misfolded proteins, such as tau tangles and Aβ plaques, disrupting normal cellular processes and leading to neuronal cell death.Genetic intervention-based therapies, such as RNA-targeting therapies can offer targeted expression changes with long-lasting effects. To be used as a pharmacological tool in the central nervous system (CNS), central delivery and wide dispersion across several tissues are required for its success. Therefore, a vehicle to ensure their safety and effective transport across the blood-brain barrier (BBB) and into target cells is required. The most exploited mechanisms for delivery across the BBB have been receptor mediated transcytosis (RMT) and carrier mediated transcytosis (CMT). For effective delivery of therapeutic molecules through RMT or CMT strong expression of target receptor or carrier protein in BBB cells is required, together with minimal expression in peripheral tissues.In this project different BBB shuttles will be explored with the purpose to further develop the final molecule. In a first step of prioritization, an in silico search was performed allowing us to reduce extensively the number of targets of interest. The reduced list was submitted to a new search in the NGN2 neuronal model and the expected expression levels were compared with Western blotting results. This reduced further the list of targets of interest that had suitable commercial antibodies. Additionally, membrane presence was also evaluated. Using different purification techniques, the proteins were separated between membrane and cytoplasmic fractions, and analysed with Western blot. Further steps to confirm membrane localization of the targets of interest are currently ongoing.