Stresse oxidativo no prognóstico e resposta aos inibidores de tirosina cinase na leucemia mieloide crónica: Relevância da variabilidade genética

Abstract

A leucemia mieloide crónica (LMC) é uma neoplasia hematológica mieloproliferativa clonal caracterizada pela presença do cromossoma Filadélfia (Ph) e da translocação t(9;22)(q34;11). Desta alteração, resulta o oncogene BCR-ABL1 que codifica a oncoproteína BCR-ABL1 com actividade tirosina cinase que constitui o alvo terapêutico dos inibidores de tirosina cinase (TKIs) utilizados no tratamento da LMC. Vários mecanismos estão envolvidos na aquisição de resistência aos TKIs dos quais os mais relevantes são os dependentes do alvo terapêutico. No entanto, o desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) e a sua eliminação pelas defesas antioxidantes, uma situação denominada de stresse oxidativo, pode também estar envolvido nos mecanismos de resistência a diversos fármacos. O gene NFE2L2 desempenha um papel fulcral e central no equilíbrio das ROS. Este fator de transcrição é regulado pela proteína adaptadora KEAP1 e, quando ativo, promove a transcrição dos genes SOD2, GPX1 e CAT. Alterações nestes genes, quer devido a mutações somáticas quer a variantes genéticas (SNV), foram associadas ao desenvolvimento de neoplasias hematológicas e à resposta terapêutica. Assim, este trabalho pretendeu avaliar o papel dos SNVs NFE2L2 (rs6721961, rs4893819, rs35652124, rs6706649 e rs13001694), KEAP1 (rs113540846), SOD2 (rs4880), GPX1 (rs1050450) e CAT (rs1001179), na resposta à terapêutica em doentes com LMC e correlacionar estas variantes com as características clinico-laboratoriais dos doentes. Para tal, foram genotipados por Tetra-Primer-ARMS-PCR, ASO-PCR e PCR-RFLP 194 doentes com LMC [idade mediana de 54 anos (15-86); homens=116 (59,8%), mulheres=78 (40,2%)]. Destes doentes, 184 foram diagnosticados em fase crónica (94,8%), 5 em fase acelerada (2,6%) e 5 em fase blástica (2,6%). A associação destas variantes genéticas com as características clínico-laboratoriais foi avaliada por análise de teste exato de Fisher (distribuições alélicas, haplótipos e perfis genotípicos) e por regressão logística (distribuições genotípicas). A influência na evolução da doença e na sobrevivência foi realizada através das curvas de Kaplan-Meier (teste Mantel-Cox). Os resultados obtidos demonstraram que as variantes NFE2L2 rs6706649 e CAT rs1001179 aumentam a probabilidade dos indivíduos serem classificados como doentes de baixo risco pelo sistema de prognóstico EURO [alelo C NFE2L2 rs6706649: odds ratio (OR)=0,488, intervalo de confiança de 95% (95%CI) 0,257-0,9227, p=0,035 e genótipo CC OR=0,429, 95%CI 0,192-0,956, p=0,039; genótipo CT CAT rs1001179: OR=0,095, 95%CI 0,010-0,939, p=0,044]. Por outro lado, doentes com a variante KEAP1 rs113540846, podem ter maior probabilidade de serem classificados como de baixo risco pelo índice EURO (genótipo GG KEAP1 rs113540846: OR=0,423, 95%CI 0,187-0,957, p=0,039) ou maior probabilidade de serem classificados como de risco intermédio ou alto (genótipo GA: OR=2,476, 95%CI 1,089-5,628, p=0,030 e genótipo GA: OR=2,514, 95%CI 1,107-5,712, p=0,028). Indivíduos com LMC com a variante CAT rs1001179 apresentam maior probabilidade de serem classificados como de risco alto ou intermédio pelo sistema de prognóstico SOKAL (alelo C: OR=2,518, 95%CI 1,090-5,817, p=0,042). Além disso, os doentes com o alelo G das variantes GPX1 rs1050450 e KEAP1 rs113540846 apresentam, respetivamente, cerca de 2 e 31 vezes pior resposta ao tratamento com o imatinib, requerendo alteração da terapêutica de primeira linha. Os doentes com o genótipo CT da variante NFE2L2 rs4893819 apresentam maior probabilidade de necessitar de trocar mais de duas vezes de TKI (genótipo CT: OR=5,600, 95%CI 1,218-25,751, p=0,027). Os indivíduos com LMC heterozigóticos para a SNV NFE2L2 rs13001694 (genótipo AG) apresentam uma probabilidade cerca de 9 vezes superior de desenvolver mutações no domínio cinásico do gene BCR-ABL1. Os doentes heterozigóticos para as variantes NFE2L2 rs4893819 (genótipo CT) e SOD2 rs4880 (genótipo AG) apresentam evolução mais rápida da doença [NFE2L2 rs4893819: hazard ratio (HR)=7,844, 95% CI 1,822-29,93, p=0,020; SOD2 rs4880: HR=7,190, 95% CI 1,618-31,96, p=0,035] e os que apresentam o genótipo GG da variante NFE2L2 rs13001694 apresentam uma sobrevivência global 2 vezes inferior à dos restantes doentes (GG 11,7 ± 2,5 anos vs. AA+AG 24,3 ± 2,6 anos;HR=11,86, 95% CI 1,397-1000,7, p=0,023). Adicionalmente, a presença do haplótipo GTTC do gene NFE2L2 (rs6721961/rs4893819/rs35652124/rs6706649) foi correlacionada com uma maior probabilidade de evolução (OR=6,160, 95%CI 1,338-28,36, p=0,036). Por fim, os doentes com o perfil genotípico GG CT TC CC AG GG GG [NFE2L2 (rs6721961)/NFE2L2 (rs4893819)/NFE2L2 (rs35652124)/NFE2L2 (rs6706649)/SOD2 (rs4880)/GPX1 (rs1050450)/KEAP1 (rs113540846)] apresentam maior probabilidade de manter MMR. Este estudo sugere que as variantes genéticas estudadas influenciam a resposta ao tratamento com TKI, assim como a progressão e a sobrevivência dos doentes com LMC.

Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative hematological neoplasm characterized by the presence of the Philadelphia chromosome (Ph) and the translocation t(9;22)(q34;11). This alteration results in the BCR-ABL1 oncogene encoding the BCR-ABL1 oncoprotein with tyrosine kinase activity which is the therapeutic target of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) used in the treatment of CML. Several mechanisms are involved in the acquisition of resistance to TKIs of which the most relevant are those dependent on the therapeutic target. However, the imbalance between the production of reactive oxygen species (ROS) and their elimination by antioxidant defenses, a situation called oxidative stress, may also be involved in the mechanisms of resistance to several drugs. The NFE2L2 gene plays a central role in the balance of ROS. This transcription factor is regulated by the adaptor protein KEAP1 and, when active, promotes transcription of the SOD2, GPX1 and CAT genes. Alterations in these genes, either due to somatic mutations or genetic variants (SNV), have been associated with the development of hematologic malignancies and therapeutic response. Thus, this work aimed to evaluate the role of SNVs NFE2L2 (rs6721961, rs4893819, rs35652124, rs6706649 and rs13001694), KEAP1 (rs113540846), SOD2 (rs4880), GPX1 (rs1050450) and CAT (rs1001179), in the response to therapy in patients with CML and to correlate these variants with clinical-labor characteristics.To this end, 194 CML patients were genotyped by Tetra-Primer-ARMS-PCR, ASO-PCR and PCR-RFLP [median age 54 years (15-86); males=116 (59.8%), females=78 (40.2%)]. Of these patients, 184 were diagnosed in chronic phase (94.8%), 5 in accelerated phase (2.6%) and 5 in blast phase (2.6%). The association of these genetic variants with clinical-laboratory characteristics was assessed by Fisher's exact test analysis (allelic distributions, haplotypes and genotype profiles) and by logistic regression (genotype distributions). The influence on disease progression and survival was performed using Kaplan-Meier curves (Mantel-Cox test).The results obtained showed that the NFE2L2 rs6706649 and CAT rs1001179 variants increase the likelihood of individuals being classified as low-risk patients by the EURO prognostic system [C allele NFE2L2 rs6706649: odds ratio (OR)=0.488, 95% confidence interval (95%CI) 0.257-0.9227, p=0.035 and CC genotype OR=0.429, 95%CI 0.192-0.956, p=0.039; CT genotype CAT rs1001179: OR=0.095, 95%CI 0.010-0.939, p=0.044]. On the other hand, patients with the KEAP1 rs113540846 variant may be more likely to be classified as low risk by the EURO index (GG KEAP1 rs113540846 genotype: OR=0.423, 95%CI 0.187-0.957, p=0.039) or more likely to be classified as intermediate or high risk (GA genotype: OR=2.476, 95%CI 1.089-5.628, p=0.030 and GA genotype: OR=2.514, 95%CI 1.107-5.712, p=0.028). Individuals with CML with the CAT rs1001179 variant were more likely to be classified as high or intermediate risk by the SOKAL prognostic system (C allele: OR=2.518, 95%CI 1.090-5.817, p=0.042). In addition, patients with the G allele of the GPX1 rs1050450 and KEAP1 rs113540846 variants have approximately 2-fold and 31-fold worse response to imatinib treatment, respectively, requiring modification of first-line therapy. Patients with the CT genotype of the NFE2L2 rs4893819 variant were more likely to require more than two TKI changes (CT genotype: OR=5.600, 95%CI 1.218-25.751, p=0.027). Individuals with CML heterozygous for SNV NFE2L2 rs13001694 (AG genotype) were approximately 9 times more likely to develop mutations in the kinase domain of the BCR-ABL1 gene. Patients heterozygous for the NFE2L2 rs4893819 (CT genotype) and SOD2 rs4880 (AG genotype) variants have faster disease progression [NFE2L2 rs4893819: hazard ratio (HR)=7.844, 95% CI 1.822-29.93, p=0.020; SOD2 rs4880: HR=7.190, 95% CI 1.618-31.96, p=0.035] and those with the GG genotype of the NFE2L2 rs13001694 variant have a 2-fold lower overall survival than other patients (GG 11.7 ± 2.5 years vs. AA+AG 24.3 ± 2.6 years; HR=11.86, 95% CI 1.397-1000.7, p=0.023). Additionally, the presence of the GTTC haplotype of the NFE2L2 gene (rs6721961/rs4893819/rs35652124/rs6706649) was correlated with a higher probability of progression (OR=6.160, 95%CI 1.338-28.36, p=0.036). Finally, patients with the genotype profile GG CT TC CC AG GG GG [NFE2L2 (rs6721961)/NFE2L2 (rs4893819)/NFE2L2 (rs35652124)/NFE2L2 (rs6706649)/SOD2 (rs4880)/GPX1 (rs1050450)/KEAP1 (rs113540846)] were more likely to maintain MMR. This study suggests that the genetic variants studied influence the response to TKI treatment as well as the progression and survival of CML patients.