THE HIDDEN PLAYER: NON-CANONICAL ROLE OF SHANK3 IN NEURODEVELOPMENT

Abstract

Autism spectrum disorders (ASDs) are characterized by social deficits along with restricted interests and repetitive behaviors. Genes encoding synaptic and structural scaffolding proteins comprise a notable portion of candidate genes involved in ASD pathology, especially proteins that mediate crosstalk between group-I metabotropic receptors (mGluRs), α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors (AMPARs) and N-Methyl-D-aspartate receptors (NMDARs). Of these, SH3 and multiple ankyrin repeat domains 3 (SHANK3) is one of the most studied proteins. Deletions in SHANK3 are associated with Phelan-McDermid Syndrome (PMS), a genetic syndrome linked to ASD that is caused by the loss of the distal segment of the long arm of chromosome 22 where SHANK3 is encoded. PMS manifestations include neurodevelopmental and behavioral deficits that translate into intellectual disability, autistic-like behaviors, hypotonia, along with impaired communication skills. The SHANK3 protein is canonically framed for its role as a core scaffold in the postsynaptic density (PSD) region, ensuring proper synaptic development and function. However, little is known about the role of this protein outside the postsynaptic density region of neurons. Though the lack of SHANK3 has been associated with deficits in synaptic maturation of neurons, calcium homeostasis of astrocytes, and myelination by oligodendrocytes, the role of SHANK3 in the common developmental progenitor of all these cells, the Neural Progenitor Cell (NPCs), has not been assessed to date. Thus, this study aims to explore the role of SHANK3 in NPCs and in the structures these cells form in in vitro cultures the neural rosettes, which recapitulate the milieu of the early neural tube.Using induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) with a truncating mutation in SHANK3 and a isogenic control line, 2D plated neural rosettes, NPCs cultures and 3D cortical brain organoids were generated to assess the impact of SHANK3 mutations on lineage differentiation. The results presented in this dissertation indicate that SHANK3 concentrates in the nucleus of NPCs, and that mutations in SHANK3 significantly affected the expression of transcription factors SOX2 and PAX6, that play a critical role in regulating the differentiation of NPCs. Additionally, alterations in the morphology and number of neural rosettes derived from SHANK3-haploinsuficient iPSCs are also described. Importantly, these alterations were recapitulated in 3D cortical brain organoids, suggesting that abnormally large neural rosettes may derive from accelerated differentiation of the cells which composed these structures. This dissertation supports the hypothesis that SHANK3 plays non-canonical roles in neurodevelopment, including the regulation of the differentiation rate of NPCs, with consequences on the size and arrangement of neural-tube-resembling structures. This work expands our understanding of SHANK3 beyond its canonical role in synaptic function. The findings presented in this work provide a foundation for further study into the intricate mechanisms by which SHANK3 might influence gene regulation and contribute to perturbations in early neurodevelopment.

As perturbações do espetro do autismo (PEA) são caracterizadas por défices sociais, juntamente com interesses restritos e comportamentos repetitivos. Os genes que codificam proteínas sinápticas e estruturais de suporte constituem uma parte notável dos genes candidatos envolvidos na patologia das PEA, especialmente as proteínas que medeiam a interação entre os recetores metabotrópicos do grupo I (mGluRs), os recetores α-Amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPARs) e os receptores N-Metil-D-aspartato (NMDARs). De entre estes, SH3 and multiple ankyrin repeat domains 3 (SHANK3) é uma das proteínas mais estudadas. As deleções na SHANK3 estão associadas à Síndrome de Phelan-McDermid (PMS), uma síndrome genética ligada às PEA, causada pela perda do segmento distal do braço longo do cromossoma 22, onde a SHANK3 está codificada. As manifestações da PMS incluem défices no neurodesenvolvimento e a nível comportamental, que se traduzem em deficiência intelectual, comportamentos do tipo autista, hipotonia, juntamente com défices nas capacidades de comunicação. A proteína SHANK3 é canonicamente enquadrada pelo seu papel como uma estrutura central na região da densidade pós-sináptica (PSD), assegurando o desenvolvimento e a função sináptica adequada. Embora pouco se saiba sobre o papel desta proteína fora da região da densidade pós-sináptica dos neurónios. Apesar da falta de SHANK3 ter sido associada a défices na maturação sináptica dos neurónios, na homeostase do cálcio nos astrócitos e na mielinização por oligodendrócitos, o papel funcional da SHANK3 no progenitor comum no desenvolvimento de todas estas células, a célula progenitora neural (CPNs), não foi avaliado até à data. Assim, este estudo teve como objetivo explorar o papel do SHANK3 nas CPNs e nas estruturas que estas células formam em culturas in vitro, as rosetas neurais, que recapitulam o ambiente celular do tubo neural inicial.Ao usar células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs), contendo uma mutação que provoca um transcrito da SHANK3 truncada e uma linha controlo isogénica, foram geradas culturas de rosetas neurais e CPNs em 2D, juntamente com organoides cerebrais corticais 3D a partir da mesma linha de iPSC, a fim de avaliar o impacto das mutações de SHANK3 na diferenciação da linhagem das CPNs.Os resultados apresentados nesta dissertação indicam que a SHANK3 se concentra no núcleo das CPNs e que as mutações na SHANK3 afetam significativamente a expressão dos fatores de transcrição SOX2 e PAX6, que desempenham um papel crítico na regulação da diferenciação das CPNs. Além disso, foram encontradas alterações na morfologia e no número de rosetas neurais derivadas de iPSCs com deficiência de SHANK3. Notavelmente, estas alterações foram recapituladas em organoides cerebrais corticais em 3D, sugerindo que as rosetas neurais anormalmente grandes descritas derivam de uma diferenciação acelerada das células que compõem estas estruturas.Esta dissertação apoia a hipótese que a SHANK3 desempenha papéis não canónicos no neurodesenvolvimento, incluindo a regulação da taxa de diferenciação das CPNs, com consequências no tamanho e na morfologia destas estruturas que se assemelham ao tubo neural. Este trabalho expande assim a nossa compreensão da SHANK3 para além do seu papel canónico na função sináptica. As descobertas apresentadas neste trabalho fornecem uma base para um estudo mais aprofundado dos mecanismos pelos quais a SHANK3 pode influenciar a regulação de genes e contribuir para perturbações no neurodesenvolvimento.