Estudo de Biomarcadores Moleculares na Doença Periodontal

Abstract

Periodontal disease (PD) is a chronic inflammatory disease that affects between 20% and 50% of the global population. It has a high frequency with advancing age and may pose a significant public health risk. Furthermore, it is described as a multifactorial condition with links to several systemic disorders, including Alzheimer's, heart disease, lung disease, diabetes, and cancer. The condition under investigation is classified as an inflammatory disease that affects the soft tissues that surround the teeth (gums), the alveolar bone, and the periodontal ligaments, especially the connective tissue collagen fibers that hold the dentition to the alveolar bone.Since this study used saliva samples from individuals at various stages of PD, it was essential to optimize the RNA extraction approach for this type of biological material, to perform genetic expression quantification analyses. Six extraction techniques were tested using the following parameters: concentration, total yield, purity ratios, and RNA integrity. According to these factors, it was discovered that the "in house" procedure, which comprises of extracting the RNA followed by purification using the ZYMO Quick RNA kit, is the best for extracting RNA from saliva samples.One of the goals of this study was to investigate the function of the TAM signaling pathway in the advancement of the distinct phases (I, II, III, and IV) of PD in humans. TAM receptors (TYRO3, MERTK, and AXL) and the GAS6 ligand were therefore measured at the mRNA level in saliva samples from patients at various stages of PD using the RT-qPCR technique. For the three genes under investigation, there was a general tendency toward decreased gene expression as illness severity increased. The ELISA/Multiplex xMAP approach was used to quantify protein levels (GAS6 and soluble TAM receptors, sTYRO3, sMERTK, and sAXL).In contrast to what was seen at the gene expression level and as previously described for other inflammatory disorders, a rise in the concentration of GAS6 and soluble TAM receptors was identified as disease severity increased. Concurrently, the inflammatory profile of these same individuals was described by Multiplex xMAP measurement of pro- and anti-inflammatory cytokines (IL-1, IL-6, TNF, IL-10, and IFN-γ). In general, there was a rise in pro-inflammatory cytokines in the most severe stages of PD, and it was also feasible to quantify the presence of specific anti-inflammatory cytokines in saliva, although at lower levels, in these stages.To sum up, this preliminary study reinforces the involvement and importance of the TAM signaling pathway in the pathogenesis and progression of PD in humans, encouraging future studies aimed at validating these findings as well as discovering new biomarkers that contribute to a better understanding of the molecular mechanisms associated with PD.

A doença periodontal (DP) é uma doença crónica inflamatória que afeta 20-50% da população mundial e que apresenta uma elevada prevalência com o aumento da idade, podendo representar um encargo substancial para a saúde pública. Para além disso, é uma doença multifatorial com uma associação a diversas doenças sistémicas, entre as quais Alzheimer, doenças cardíacas, doenças respiratórias, diabetes e cancro. A doença em estudo, caracteriza-se como uma doença inflamatória que afeta os tecidos moles que circundam os dentes (as gengivas), o osso alveolar e os ligamentos periodontais, nomeadamente as fibras de colagénio do tecido conjuntivo que fixam a dentição ao osso alveolar. Uma vez que este trabalho foi realizado com recurso a amostras de saliva de pacientes em diferentes estágios da DP, primeiramente foi necessário otimizar uma estratégia de extração de RNA a partir deste tipo de amostra biológica, de forma a serem efetuadas as análises de quantificação da expressão génica. Assim, foram avaliados 6 métodos de extração tendo em consideração os seguintes parâmetros: concentração, rendimento total, rácios de pureza e a integridade do RNA. De acordo com estes parâmetros, constatou-se que o método designado “in house”, que consiste na extração do RNA seguida pela purificação do mesmo com o kit ZYMO Quick RNA é o mais indicado para a realização de extração de RNA a partir de amostras de saliva. Um dos objetivos do presente trabalho foi determinar o papel da via de sinalização TAM durante a progressão dos diferentes estágios (I, II, III e IV) da DP em humanos. Assim sendo, quantificou-se a partir de amostras de saliva de pacientes em diferentes estágios da DP a expressão dos recetores TAM (TYRO3, MERTK e AXL) e do ligando GAS6 ao nível do mRNA através da técnica RT-qPCR. De uma formal geral, verificou-se uma tendência na redução da expressão génica com o aumento da severidade da doença para os três genes em estudo. A quantificação ao nível da proteína (GAS6 e recetores TAM solúveis, sTYRO3, sMERTK e sAXL) foi efetuada através da técnica ELISA/Multiplex xMAP. Contrariamente ao observado ao nível da expressão génica e como previamente reportado para outras doenças inflamatórias, foi detetado um aumento na concentração de GAS6 e recetores TAM solúveis com o aumento da severidade da doença. Em simultâneo, caracterizou-se o perfil inflamatório desses mesmos pacientes 7através da quantificação por Multiplex xMAP de citocinas pro- e anti-inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNFα, IL-10 e IFN-γ). No geral, observou-se uma tendência no aumento das citocinas pro-inflamatórias nos estágios mais severos da DP, e foi igualmente nestes estágios que foi possível quantificar na saliva, embora em níveis mais baixos, a presença de determinadas citocinas anti-inflamatórias.Em suma, este estudo preliminar reforça o envolvimento e importância da via de sinalização TAM na patogénese e progressão da DP em humanos, incentivando assim a realização futura de estudos que visem a validação destes resultados bem como a descoberta de novos biomarcadores que contribuam para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares associados à DP.