Modulation of effector functions of NK cells by human purified immunoglobulin G and recombinant protein analogs

Abstract

As células natural killer (NK) têm um papel fundamental na resposta inata do sistema imunitário através da eliminação de células infetadas com vírus, células em situações de stress, células cancerígenas e células estranhas ao corpo sem necessidade de reconhecimento de antigénios. As células NK eliminam os seus alvos através de mecanismos de citotoxicidade direta, citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e através de vias como FasL/TRAIL, bem como através da produção de citocinas, incluindo interferon-gama (IFN-γ) e o fator de necrose tumoral (TNFalpha).A perda da capacidade do sistema imunitário de diferenciar entre antigénios “próprios” e “não-próprios” é a principal causa relacionada com autoimunidade. Para além de corticoides e fármacos imunossupressores, uma segunda linha de tratamento para patologias autoimunes são as imunoglobulinas intravenosas (IVIG). A grande necessidade das IVIG juntamente com a disponibilidade limitada de plasma humano, a matéria-prima para a purificação das IVIG, resultou numa escassez a nível mundial, que se agravou com a pandemia da Covid-19. Uma alternativa é a produção de imunoglobulinas G recombinantes (IgG), como por exemplo um hexâmero (HEX) composto pela porção Fc da subclasse IgG1 fundido com a parte final (μ-tailpiece) de uma imunoglobulina M (IgM). No entanto, antes de se realizarem estudos clínicos com esta molécula, será necessário realizar estudos mecanísticos adicionais. Esta tese teve como objetivo principal:(i) Estabelecer ensaios de citotoxicidade direta e citotoxicidade dependente de anticorpos (ADCC) para explorar o efeito das IVIG ou de moléculas humanas IgG recombinantes e seus análogos na atividade citotóxica das células NK. (ii) Caracterizar o perfil de citocinas libertadas pelas células NK na presença das IVIG e de moléculas humanas IgG recombinantes.Inicialmente foram estabelecidas as condições experimentais com o intuito de ter ensaios de citotoxicidade direta e de ADCC confiáveis, utilizando linhas celulares K562 e Daudi como alvos, respetivamente. De seguida, foi avaliado o impacto das IVIG e das moléculas IgG recombinantes e os seus análogos na atividade citotóxica das células NK. Por fim, através da utilização de ensaios de cytometric bead array (CBA), o perfil de citocinas libertadas pelas células NK após incubação noturna com IVIG e das moléculas IgG recombinantes com diferentes afinidades aos recetores das NK (HEXlowR3, HEXlowR2 and MONO) foi caracterizado.Os resultados desta tese demonstram que o HEX é o inibidor mais potente dos ensaios de ADCC utilizando um anticorpo monoclonal anti-CD20 e células Daudi como alvo. No caso de ensaios de citotoxicidade direta, as IVIG induziram maior inibição. Também se observou que o HEX, na concentração mais alta testada (0.25 mg/ml), aumentou os níveis de citocinas libertados pelas células NK; em particular, a secreção de TNFalpha foi maior em comparação com IFN-γ, apesar de terem sido detetadas diferenças entre os diferentes dadores.Em suma, os resultados apresentados nesta tese contribuíram para uma melhor compreensão dos mecanismos de ação das IVIG e das moléculas recIgG e os seus análogos. As isoformas do HEX poderão ter bastante potencial clínico em termos de tratamento de doenças desencadeadas por autoanticorpos.

Natural killer (NK) cells play a fundamental role in innate immune responses by eliminating virally infected, stressed, cancer and foreign cells in the absence of antigen presentation. NK cells eliminate their targets by direct cytotoxicity, antibody dependent-cell cytotoxicity (ADCC) and death ligand pathways (FasL/TRAIL) mechanisms in addition to the production of cytokines, including interferon-gamma (IFN-γ) and tumor necrosis factor alpha (TNFalpha).The loss of the immune system's capacity to differentiate between “self” and “nonself” antigens is the primary cause of autoimmunity. Beside corticosteroids and classical immunosuppressive drugs, a second line of treatment for autoimmune pathologies are intravenous immunoglobulins (IVIG). The high clinical demand for IVIG along with a limited supply of human plasma, the raw material for the purification of IVIG, has resulted in a worldwide shortage, which has been aggravated by the Covid-19 pandemics. An alternative is to manufacture recombinant immunoglobulin G (IgG), for example a hexamer (HEX) composed of IgG1 subclass Fc portions fused to an IgM μ-tailpiece. However, before clinic studies can be conducted with this product, additional mechanistic studies are needed. The overall goal of this thesis was:(i) To establish reliable direct cytotoxicity and ADCC assays to further explore the impact of IVIG or recombinant human IgGs molecules and analogs on the cytotoxic activity of NK cells. (ii) To characterize the cytokine profile released by NK cells in the presence of IVIG and recombinant human IgG molecules.First, it was established the detailed experimental conditions for reliable direct cytotoxicity and ADCC assays using the K562 and Daudi cell lines as target cells, respectively. Further, the impact of IVIG or recombinant human IgGs molecules and analogs on the cytotoxic activity of NK cells was assessed. Finally, using cytometric bead array (CBA) assays it was characterized the cytokine profile released by NK cells after overnight incubation with IVIG or recIgGs molecules and analogs of recIgG with different affinities to NK cells’ receptors (HEXlowR3, HEXlowR2 and MONO).This thesis findings show that HEX is the most potent inhibitor in ADCC assays using a monoclonal anti-CD20 antibody and Daudi cells as targets. In the case of direct cytotoxicity assays, IVIG induced the greatest inhibition. It was also observed that HEX, at the highest concentrations tested (0.25 mg/ml), increased the amounts of cytokines released by NK cells; in particular, TNFalpha secretion was higher in comparison with IFN-γ, although interindividual differences were detected among the donors.Overall, the results of this thesis contribute to a better understanding of the mechanisms of action of IVIG and recIgG molecules and analogs. HEX isoforms may have a potential in the clinic as treatment for autoantibody-mediated diseases.