Validação do equipamento Applied Biosystems™ SeqStudio™ Genetic Analyzer

Abstract

As atividades desempenhadas pela Genética Forense centram-se na determinação e análise de perfis de ADN, particularmente de zonas do genoma nuclear humano altamente polimórficas designadas Short Tandem Repeats (STRs), pelo grande potencial que as mesmas apresentam em distinguir e identificar indivíduos. Os perfis genéticos são atualmente obtidos sob a forma de eletroferogramas (EFs), através da separação e deteção fluorescente desses fragmentos específicos por eletroforese capilar (EC), em sequenciadores automáticos. Uma vez que os perfis são frequentemente usados como prova em tribunal, podendo deles derivar decisões jurídicas sobre os indivíduos envolvidos em processos judiciais, é de extrema importância garantir a veracidade dos resultados obtidos e a confiança na aptidão instrumental dos equipamentos que os geraram. Por essa razão, é necessário que os sequenciadores automáticos utilizados nos laboratórios de genética forense estejam devidamente validados, assegurando assim, que a sua utilização permitirá uma correta resolução de questões legais.Com o presente trabalho pretendeu-se validar internamente o novo sequenciador automático Applied BiosystemsTM SeqStudioTM Genetic Analyzer recentemente adquirido pelo SGBF-C, contribuindo para a sua futura introdução na rotina laboratorial do serviço. Para proceder à validação interna do SeqStudioTM, foram estudados os seus limiares de sensibilidade, e realizados estudos comparativos entre ele e o sequenciador em atual utilização no SGBF-C e já completamente validado - Applied Biosystems™ 3500 Genetic Analyzer. Para isso, recorreu-se a amostras de sangue e saliva da rotina do SGBF-C. O ADN das amostras foi extraído através de Prep-n-GoTM e PrepFiler ExpressTM, a sua quantificação foi realizada com recurso ao kit QuantifilerTM Trio, e a sua amplificação com o kit GlobalFilerTM. As amostras foram aplicadas nas condições padrão de eletroforese, a 10s de injeção, e os EFs obtidos foram analisados no software GeneMapper™ ID-X.Este estudo de validação permitiu determinar os Limiares Analítico, de Stutter, Estocástico e de Desequilíbrio de Heterozigóticos, como parâmetros a estabelecer no SGBF-C, para garantir corretas conclusões aquando da análise e interpretação dos perfis gerados pelo SeqStudioTM para amostras amplificadas com GlobalFilerTM. Comprovou-se a capacidade do SeqStudioTM em produzir perfis equivalentes aos do 3500, e demonstrou-se que o mesmo se encontra apto para executar a sua função de EC, nas condições laboratoriais do SGBF-C, para fins de identificação humana. Este trabalho possibilitou também caraterizar as principais vantagens e limitações do SeqStudioTM face ao 3500.

The activities performed by Forensic Genetics focus on the determination and analysis of DNA profiles, particularly of highly polymorphic areas of the human nuclear genome called Short Tandem Repeats (STRs), due to their enormous potential to distinguish and identify individuals. Genetic profiles are currently obtained in the form of electropherograms, through the separation and fluorescent detection of these specific fragments by capillary electrophoresis, in automated DNA sequencers. Since profiles are often used as evidence in court and can lead to legal decisions over individuals involved in forensic cases, it is extremely important to guarantee the veracity of the results obtained and confidence in the instrumental aptitude of the equipment that generated them. For this reason, the automated sequencers used in forensic genetics laboratories must be properly validated, thus ensuring that their use will allow a correct resolution of legal issues.The present work aimed to internally validate the new Applied BiosystemsTM SeqStudioTM Genetic Analyzer automated sequencer recently acquired by the SGBF-C, thus contributing to its future introduction in the laboratory routine.To perform the internal validation of SeqStudioTM, its sensitivity thresholds were studied, and comparative studies were conducted between it and the sequencer currently used in the SGBF-C and already fully validated - Applied Biosystems™ 3500 Genetic Analyzer. For this, blood and saliva samples from the SGBF-C routine were used. The samples’ DNA was extracted using Prep-n-GoTM and PrepFiler ExpressTM, its quantification was performed using the QuantifillerTM Trio kit, and its amplification with the GlobalFilerTM kit. The samples were applied under standard electrophoresis conditions, at the injection time of 10s, and the electropherograms obtained were analyzed under the GeneMapper™ ID-X software.This validation study allowed to determine the Analytical, Stutter, Stochastic and Heterozygotic Imbalance Thresholds, as parameters to be established in the SGBF-C, to ensure correct conclusions when analyzing and interpreting the profiles generated by SeqStudioTM for samples amplified with GlobalFilerTM. The ability of SeqStudioTM to produce profiles equivalent to those of the 3500 was proved, and it was demonstrated that it is able to perform its EC function, under the laboratory conditions of the SGBF-C, for human identification purposes. This work also made it possible to characterize the main advantages and limitations of SeqStudioTM compared to the 3500.