Aplicação da Toxicologia Forense na determinação de xenobióticos em amostras de sangue por cromatografia líquida associada a espetrometria de massa

Abstract

A Cannabis é a droga ilícita mais usada no mundo, integrando a maioria dos registos das infrações de posse/consumo de substâncias ilícitas. A planta é constituída por uma elevada variedade de compostos, dentro dos quais se incluem os canabinóides, podendo apresentar um forte efeito psicoativo. Estes compostos caracterizam-se por serem constituídos por mais de 21 átomos de carbono, assim como por se encontrarem, exclusivamente, na planta Cannabis sativa, sendo o Δ9-tetrahidrocanabinol (Δ9-THC) o composto ativo com maior poder psicoativo. Em toxicologia forense, é essencial ter um método rápido e eficiente que permita usar uma pequena quantidade de amostra biológica para a determinação e quantificação de baixas concentrações de canabinóides.Assim, foi estudada a técnica de precipitação proteica com acetonitrilo de 0,1 mL de amostra de sangue, para a determinação de Δ9-THC, 11-hidroxi-Δ9-tetrahidrocanabinol (11-OH-THC) e 11-nor-9-carboxi-Δ9-tetrahidrocanabinol (THCCOOH), por cromatografia líquida de alta resolução acoplada a espetrometria de massa (LC-MS/MS), em modo de scan de monitorização de reações múltiplas (MRM). Na separação cromatográfica foi utilizada uma coluna Acquity UPLC® HSS T3 (100 mm x 2,1 mm, 1,8 µm), uma fase móvel em gradiente constituída por formato de amónia aquoso 2 mM (ácido fórmico 0,1%) e metanol, com um fluxo de 0,4 mL/min, um volume de injeção de 5 µL e um tempo de corrida de 10 min. O método foi validado de acordo com critérios e diretrizes internacionalmente aceites. O método em modo MRM demonstrou ser seletivo e linear entre 0,5-100 ng/mL (r2>0,998). Os limites inferiores de quantificação (LQ) corresponderam à menor concentração utilizada para as curvas de calibração. Os coeficientes de variação obtidos para a exatidão e precisão foram inferiores a 20% e reprodutibilidade obteve valores aceitáveis (z-score < 3). As recuperações médias encontram-se entre 94% e 96% para os níveis de concentração estudados (1 ng/mL, 5 ng/mL e 50 ng/mL). O efeito matriz traduz-se num efeito de intensificação iónica para todos os analítos. Não foram observados compostos interferentes significativos ou arrastamento.O método validado fornece um procedimento sensível, eficiente e robusto para a quantificação de canabinóides no sangue por aplicação de precipitação proteica de 0,1 mL de amostras analisadas por LC-MS/MS.

Cannabis is the most used illicit drug in the world, integrating most records of offenses of possession/consumption of illicit substances. The plant contains an extensive variety of compounds, including cannabinoids, which may have a strong psychoactive effect. These compounds are characterized by being constituted of more than 21 carbon atoms, as well as being found exclusively in the Cannabis sativa plant, with Δ9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) being the active compound with the highest psychoactive power. In forensic toxicology, it is essential to have a fast and efficient method that allows the use of a small amount of biological sample for the determination and quantification of dangerous amounts of cannabinoids.Therefore, the protein precipitation technique with acetonitrile of 0,1 mL of blood samples was studied for the determination of Δ9-THC, 11-hydroxy-∆9- tetrahydrocannabinol (11-OH-THC), 11-Nor-9-carboxy-Δ9-tetrahydrocannabinol (THCCOOH), by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS), in multiple reaction monitoring (MRM) scan mode. In the chromatographic separation, an Acquity UPLC® HSS T3 column (100 mm x 2,1 mm, 1,8 µm) was used, as well as a gradient mobile phase consisting in 2 mM aqueous ammonium formate (0,1% formic acid) and methanol, a flow rate of 0,4 mL/min, an injection volume of 5 μL and a run time of 10 min. The method was validated in accordance with internationally accepted criteria and guidelines.The method in MRM mode, the method proved to be selective and linear between 0,5-100 ng/mL (r2>0.998). The lower limits of quantification (LQ) corresponded to the lowest concentration used for the calibration curves. The coefficients of variation obtained for accuracy and precision were less than 20% and reproducibility obtained acceptable values (z-score < 3). The mean recoveries were between 94% and 96% for the studied concentration levels (1 ng/mL, 5 ng/mL and 50 ng/mL). The matrix effect translates into an ion-enhancing effect for all analytes. No significant interfering compounds or carryover were observed.The validated method provides a sensitive, efficient and robust procedure for the quantification of cannabinoids in blood by applying protein precipitation to 0,1 mL of samples analyzed by LC-MS/MS.