Establishment of a Novel and Personalized Bone Marrow 3D Ex Vivo Model for Multiple Myeloma Treatment

Abstract

Multiple myeloma (MM) is characterized by the clonal expansion of terminally differentiated B cells in the bone marrow (BM), overproduction of monoclonal immunoglobulins and end-organ damage, such as hypercalcemia, renal insufficiency, anemia, or bone lesions (CRAB). Accounting for 10% of all hematological malignancies, this is a challenging, progressive, and heterogeneous disease, that still remains without a cure. A significant part of the patients evolves between periods of remission and relapse, and most of them develop drug resistance to all therapies and maintain a poor overall survival. Despite the progresses made in the last years, there are still several aspects of cellular and molecular nature that need to be further studied and addressed, to fill the gaps regarding MM pathophysiology. This is crucial to assess the personal MM characteristics of each patient and the best, safest and most relevant treatment approach. MM cells grow within the BM niche, and the crosstalk between these tumoral cells and its microenvironment plays a critical role in disease progression, allowing for immune evasion, proliferation, migration, and survival. Current research performed in vitro or using MM animal models often leads to poor predictions when compared to clinical outcomes. The in vitro models are mainly two-dimensional and use cell line monocultures that have lost their bone marrow dependence, representing an unfaithful recapitulation of tissue architecture, biochemical intrinsic properties, cell interactions, or the personal heterogeneity aspects of the disease. Mouse models also have limitations, as the murine immune system varies significantly from the human one. Immunodeficient mice impede the study of immune and cancer cells interactions in the microenvironment, and humanized models are expensive and time-consuming. In this project, we developed and characterized a three-dimensional ex vivo co-culture model of MM, capable of mimicking each patient's BM microenvironment with its cellular, biophysical and biochemical cues. Whole samples were obtained from BM aspirates of MM patients, and cells were embedded in a Matrigel matrix, after lysis of red blood cells. After determining the optimal culture conditions of our model, multiparametric flow cytometry was used to identify and quantify the different cell populations present inside the matrix. Confocal imaging was used to spatially assess cellular distribution and death within the model. Resistant and sensitive MM cell lines were cultured in 3D and treated with lenalidomide, to validate the use of the model for studying drug response. This patient-derived 3D ex vivo model was able to sustain 60% viability of seeded cells after 14 days of culture. After 7 days in culture, BM cellular subpopulations presented similar proportions to patient sample on day 0, including fibroblasts, myeloid and T cells, and MM cells, indicating a good recapitulation of the in vivo MM-BM setting. MM cell lines responded to lenalidomide treatment according to their cell line characteristics. Resistant cells kept viability, and proliferative and migrative activity, and sensitive cells started to die, and lost their activity, compared to the control group. This model may provide a powerful tool for patient-individualized profiling and holds potential for easy and low-cost research and clinical applications.

O mieloma múltiplo (MM) é caracterizado pela proliferação anormal de células B diferenciadas, na medula óssea (MO), aumento da produção de imunoglobulinas monoclonais e lesões em diferentes órgãos, incluindo hipercalcemia, insuficiência renal, anemia e lesões ósseas (CRAB). O MM representa 10% das neoplasias hematológicas, sendo uma doença heterogénea e progressiva, para a qual ainda não existe cura. A maior parte dos doentes oscila entre períodos de remissão e recaída, acabando por desenvolver resistência às terapias, com uma baixa taxa de sobrevivência. Apesar dos notáveis avanços feitos nos últimos anos, existem ainda vários aspetos relacionados com a natureza celular e molecular do mieloma que requerem uma maior compreensão. Esta informação é crucial para poder determinar as características fisiopatológicas pessoais de cada doente, bem como selecionar a melhor opção terapêutica, em termos de segurança e eficácia. As células do mieloma crescem no microambiente medular. A interação entre as células tumorais e o ambiente envolvente desempenha um papel crítico na progressão da doença, permitindo a evasão imunológica, proliferação, migração e sobrevivência. Atualmente, a investigação feita in vitro ou com modelos animais de MM, acaba por resultar em previsões pouco precisas, quando comparadas com os resultados clínicos. Os modelos in vitro são maioritariamente culturas 2D e monoculturas com linhas celulares, que perderam a sua dependência medular característica, constituindo uma representação imperfeita da arquitetura do tecido, propriedades bioquímicas, interações celulares ou aspetos da heterogeneidade pessoal da doença. Os modelos animais também apresentam limitações, uma vez que o sistema imunitário murino varia significativamente do humano. Murganhos imunodeficientes impedem o estudo das interações entre as células imunes e tumorais no microambiente medular, e os modelos humanizados são caros e demorados. Neste projeto, desenvolvemos e caracterizámos um modelo tridimensional de co-cultura ex vivo de MM, capaz de mimetizar o microambiente da MO de cada doente, com as suas propriedades celulares, biofísicas e bioquímicas. Amostras de aspirado medular foram recolhidas de doentes com MM, e as células foram incorporadas numa matriz de Matrigel, após lise dos eritrócitos. Depois de determinar as condições ideais de cultura do nosso modelo, as diferentes populações celulares presentes na matriz foram identificadas e quantificadas, através de citometria de fluxo. A distribuição e morte celular no modelo foram avaliadas espacialmente, através de microscopia confocal. Linhas celulares de MM, resistentes e sensíveis a tratamento, foram incluídas no modelo 3D e tratadas com lenalidomida, para validar o uso do modelo em testes de resposta a agentes terapêuticos. Este modelo 3D ex vivo, derivado de amostras de doentes, manteve 60% de viabilidade das células cultivadas, durante 14 dias. Depois de 7 dias em cultura, as subpopulações celulares da medula óssea apresentaram proporções semelhantes às da amostra do doente ao dia 0, incluindo fibroblastos, células T e mielóides, e células de mieloma, indicando uma boa representação do cenário medular in vivo, em contexto de mieloma múltiplo. As células do mieloma responderam ao tratamento com lenalidomida de acordo com as características da linha celular. As células resistentes mantiveram a viabilidade e a sua atividade proliferativa e migratória, e as células sensíveis começaram a morrer, perdendo a sua atividade, em relação ao grupo controlo. Este modelo pode assumir-se como uma ferramenta relevante para caracterização individualizada dos doentes e apresenta potencial para estudos e aplicações clínicas, fáceis e de baixo custo.